爱罗咳喘宁对慢性阻塞性肺疾病大鼠肿瘤坏死因子-α、巨噬细胞炎性蛋白-2、髓过氧化物酶、炎细胞及肺组织病理变化的影响

尚立芝　张紫娟　谢文英　张良芝　常学辉胡文豪　(河南中医学院，河南　郑州　450008)



爱罗咳喘宁对慢性阻塞性肺疾病大鼠肿瘤坏死因子-α、巨噬细胞炎性蛋白-2、髓过氧化物酶、炎细胞及肺组织病理变化的影响

尚立芝张紫娟谢文英张良芝常学辉1胡文豪(河南中医学院，河南郑州450008)

〔摘要〕目的观察爱罗咳喘宁口服液对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺匀浆中肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2、和髓过氧化物酶(MPO)变化及肺组织结构的影响，探讨爱罗咳喘宁方对COPD作用的可能机制。方法采用脂多糖(LPS)加烟雾诱导COPD大鼠模型，大鼠被随机被分为正常组、模型组、爱罗咳喘宁口服液低、中、高剂量组。正常组、模型组灌胃蒸馏水(10 g·kg－1·d－1)，爱罗咳喘宁口服液低、中、高剂量组分别灌胃混悬液5，10，20 g·kg－1·d－1，连续7 d。酶联免疫法(ELISA)测定各组大鼠BALF和肺组织匀浆中TNF-α和MIP-2的含量，比色法测定MPO活性。结果与正常组比较，模型组BALF和肺组织匀浆TNF-α、MIP-2和MPO均显著升高(P均＜0. 05);与模型组相比，爱罗咳喘宁口服液中剂量组TNF-α、MIP-2和MPO均显著降低(P均＜0. 05)。结论爱罗咳喘宁口服液治疗COPD的作用机制可能与抑制TNF-α、MIP-2和MPO的释放有关。

〔关键词〕慢性阻塞性肺疾病;肿瘤坏死因子-α;巨噬细胞炎性蛋白-2;髓过氧化物酶

1河南省中医院

第一作者:尚立芝(1960-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事中药方剂基础与临床研究。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以慢性非特异性气道炎症为主要病变特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，发病率和病死率随着年龄的增长而增加〔1〕。COPD的发病机制目前未完全清楚，由多种炎症细胞及炎症介质参与且相互作用所致，中性粒细胞在气道腔内大量聚集、活化、释放蛋白酶等多种酶类及氧自由基等，导致支气管肺组织损伤。COPD主要临床表现咳嗽、咳痰等呼吸道症状，属中医“咳嗽”?、“痰饮”、“喘证”等范畴。中医认为本病其标在肺，其本在脾、肾。本课题组根据方证相关自拟爱罗咳喘宁方，兼顾宣肺化痰、止咳平喘、健脾固肾。经多年临床和前期动物实验研究结果均显示，爱罗咳喘宁口服液能显著提高COPD患者和动物模型的肺功能、改善肺组织结构，但其作用机制不明〔2～7〕。本研究观察爱罗咳喘宁对COPD大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织匀浆中参与炎症反应的肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2、髓过氧化物酶(MPO)及病理变化的影响。

1　材料与方法

1. 1药物爱罗咳喘宁方药物组成:炙麻黄6 g，苦杏仁10 g，茯苓15 g，赤芍10 g，半夏10 g，葶苈子10 g，苍术10 g，干姜6 g，麦芽20 g，白术12 g，山药15 g，党参15 g，芫花6 g等，以上药物经河南中医学院董诚明教授鉴定，由河南中医学院第一附属医院制剂室制成口服液，真空包装，每支100 ml，含生药100 g。

1. 2试剂与仪器测定BALF和肺组织匀浆中TNF-α和MIP-2含量ELISA试剂盒、MPO活性试剂盒均购于南京建成生物工程有限公司。自制动物熏吸箱(50 cm×50 cm×40 cm)，18号静脉套管针，脂多糖(LPS，solarbio公司，L8880，701c034)，红旗渠牌香烟(烤烟型，焦油含量14 mg/支，尼古丁含量1. 1 mg/支，河南安阳卷烟厂)。电热恒温培养箱(金坛市白塔新宝仪器厂，DHP-260)，318C酶标仪(上海精密科学仪器有限公司)，TGL-16GA低温高速离心机(上海安亭仪器厂)，VIS-7220型分光光度仪(北京第二光学仪器厂)，FAME16/30F全自动酶标议(瑞士哈美顿公司)。U-CMAD3型显微镜(日本OLYMPUS)，显微摄像仪OLYMPUS TOKYO(JAPAN 20486)等。

1. 3动物6月龄雄性SD大鼠50只，清洁级，体质量(300± 20)g。由河南省实验动物中心提供(HNLA-2010-111)。随机分为五组:正常组、模型组、爱罗咳喘宁口服液低、中、高剂量组(5，10，20 ml·kg－1·d－1)组，每组10只。

1. 4模型制备参照文献〔7，8〕制备LPS加烟雾诱导COPD大鼠模型。采用气管注脂多糖加熏香烟方法:在第1，14天，用1%的戊巴比妥钠(40 mg/kg)ip麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，暴露声门，将18号静脉套管针快速插入气管，拔出针芯，用1 ml注射器注入溶于生理盐水的LPS200 μl(1 mg/ml)，然后将大鼠固定板直立旋转，使LPS能够均匀分布于两肺。第2～28天(第14天除外)将大鼠置入熏箱内，内熏香烟烟雾，40 min/次，2次/d(每次8支烟)，每周休息1 d;正常组，第1天、第14天经气管注入200 μl生理盐水，其余无特殊处理。

1. 5给药方案参考文献〔9〕，正常组、模型组灌胃给予蒸馏水(10 g·kg－1·d－1)，各治疗组大鼠给予爱罗咳喘宁口服液低、中、高剂量组分别灌胃混悬液(5，10，20 g·kg－1·d－1)，连续7 d。

1. 6 BALF的制备及TNF-α、MIP-2、MPO检测断头处死大鼠，开胸暴露气管和肺门，结扎右主支气管。用套管针穿刺至左肺，以生理盐水2ml×3次行肺泡灌洗，回收率约80%，BALF存入可防止细胞附壁的硅塑管内静置1 h。取1 ml BALF以2 000 r/min离心5 min后，取上清液置入EP管保存于－20℃冰箱中待检。检测BALF上清液中TNF-α、MIP-2及MPO浓度测定，均按照试剂盒说明书操作。

1. 7肺组织匀浆TNF-α、MIP-2浓度及MPO活性测定〔10〕取各组大鼠右肺组织1. 0 g，在预冷的生理盐水中漂洗，除去血液，用滤纸拭干，用冷盐水制备成10%的肺匀浆，将10%匀浆于4℃离心2 000 r/min离心10 min收集上清液，－20℃冻存待测。用ELISA测定上清液TNF-α、MIP-2浓度。按照试剂盒说明书操作在酶标仪450 nm波长处，以空白对照孔调零，直接测定吸光度(A)值，并由标准曲线公式换算成各蛋白的浓度值。根据南京建成生物工程研究所提供的MPO测定试剂盒说明书，进行分光光度计比色测定MPO活性。

1. 8 HE染色标本制备取右下肺组织，10%甲醛固定，常规包埋切片，HE染色。

1. 9统计学处理采用SPSS11. 5统计软件包行方差分析。

2　结果

2. 1大鼠一般情况实验结束时，正常组，一般状况好，体重增长，无死亡。模型组，体重较造模前下降或略有增加，死亡2只。爱罗咳喘宁高、中、低剂量组大鼠体重增加，高、低剂量组各死亡1只。

2. 2 BALF和肺匀浆中TNF-α、MPO和MIP-2变化模型组BALF中TNF-α、MIP-2和MPO都显著高于正常组(P均＜0. 05);爱罗咳喘宁低、中、高剂量组TNF-α、MIP-2和MPO都显著低于模型组(P均＜0. 05，表1)。与正常组比较，模型组肺匀浆中TNF-α、MIP-2和MPO均显著升高(P均＜0. 05);与模型组相比，爱罗咳喘宁低、中、高剂量组TNF-α、MIP-2和MPO均显著降低(P均＜0. 05)。见表2。

表1　爱罗咳喘宁对各组大鼠BALF中TNF-α、MIP-2和MPO的影响(x±s)

表2　爱罗咳喘宁对各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、MIP-2和MPO的影响(x±s)

2. 3病理学改变

2. 3. 1大体形态观察正常组肺脏颜色略呈粉红色，表面光滑无斑点。模型组肺脏较大，暗红，边缘钝圆，多数肺脏表面有局部隆起现象;各治疗组肺脏增大，色泽深红，小部分肺脏边缘钝圆，表面不光滑呈点状隆起，但没有模型组明显。

2. 3. 2组织切片(HE染色)光镜下显示，正常组气管、支气管黏膜，上皮细胞排列整齐，无变性、坏死及脱落，管壁各层均无炎细胞浸润和增生，气道管腔内无渗出物;肺泡结构正常。模型组细支气管管腔内有渗出物，细支气管管壁上皮多处变性、坏死而脱落，管壁各层炎细胞明显浸润;部分血管周围水肿，局部细支气管管壁因血管充血、间质水肿而增厚，腔内有分泌物，细支气管周围肺泡扩张、融合，部分肺大泡，其附近局限性肺不张。高剂量组多数细支气管壁周围淋巴细胞聚集成为淋巴滤泡。与模型组比较，爱罗咳喘宁中剂量组肺组织病理改变较模型组轻，细支气管黏膜损害较浅，上皮趋于完整，细支气管腔内少量渗出物;肺泡内出现少量巨噬细胞和红细胞、部分肺泡扩张。肺组织充血减少，除血管壁外周有轻度水肿外，肺组织基本正常。爱罗咳喘宁低剂量组与模型组接近，疗效较差。见图1。

图1　爱罗咳喘宁对肺组织结构的影响(HE，×100)

3　讨论

COPD临床表现属中医“咳嗽”、“痰饮”、“喘证”等范畴。中医认为“虚”、“痰”、“瘀”、“气滞”，累及肺、脾、肾三脏，故解决患者的“咳”、“痰”、“喘”等症，其关键在于:宣肺降肺;益气行气;化痰祛瘀;健脾益肾。基于方证相关理论，创立了爱罗咳喘宁方，方中炙麻黄主治肺气壅遏，杏仁祛痰平喘，半夏燥湿化痰，葶苈子祛痰平喘;干姜温肺化饮;茯苓健脾化痰;芫花祛痰止咳。党参健脾益肺，白术健脾益气，山药固肾益精;苍术燥湿健脾，麦芽健脾和胃，赤芍活血祛瘀〔5〕。

研究表明，COPD气道与肺实质的持续炎症病变涉及炎症细胞释放的各种炎症介质。在COPD炎症中TNF-α升高〔11，12〕，是COPD病情加重的一个重要指标，也是COPD严重程度的重要标志〔13〕。

MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，主要存在于中性粒细胞中。MPO可通过脂质过氧化作用引起肺组织损伤。MPO活力变化代表着中性粒细胞功能和活性状态，MPO可作为中性粒细胞的活化标志物〔14〕。MPO反映中性粒细胞的浸润情况，又可定量反映炎性损伤的程度。本实验用LPS加烟雾制备COPD大鼠模型结果与彭红星等〔15〕报道结果相一致，说明在COPD大鼠气道确实存中性粒细胞的聚集，活化，提示模型组气道内中性粒细胞脱颗粒释放过量的MPO等酶类和细胞因子，诱导了气道炎症和组织损伤。

MIP-2是肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞分泌的蛋白质产物，气道内中性粒细胞的聚集和活化与一些特异性的趋化因子活性作用密切相关〔16〕。MIP-2是一种趋化因子，其特异靶细胞为中性粒细胞，对其起重要的趋化和激活作用。本实验结果与茅培英等〔17〕报告结果相一致，提示在COPD模型中MIP-2可能通过对中性粒细胞的化学趋化作用和活化作用参与了炎细胞在气道及肺组织内的聚集，导致中性粒细胞脱颗粒释放过量MPO、蛋白酶、弹性酶等溶解细胞外基质进而炎细胞浸润，诱发炎症反应和肺组织损伤〔18，19〕，这可能是COPD炎症形成的可能机制之一。

COPD的病理基础是慢性气道炎症，以气道中的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润为主。本研究结果显示，与正常组比较，模型组BALF和肺组织匀浆中TNF-α、MPO和MIP-2均显著增高，与文献报道〔20〕相近，提示TNF-α、MPO和MIP-2共同参与COPD炎症反应。本研究显示爱罗咳喘宁可减低BALF和肺组织匀浆中TNF-α、MPO和MIP-2水平，从而发挥其抗炎作用，肺组织病理形态也予以证实。这可能是爱罗咳喘宁治疗COPD的作用机制之一。

4参考文献

1钟南山.慢性阻塞性肺疾病在中国〔J〕．中国实用内科杂志，2011; 31(5): 321-2.

2郭岩斐，孙铁英.支气管扩张剂对老年阻塞性气道疾病的治疗现状〔J〕．中国新药杂志，2010; 19(20): 1859-65.

3谢文英，景晓平.爱罗咳喘口服液治疗支气管哮喘42例〔J〕．中国中医药信息杂志，2005; 12(2): 82-3.

4谢文英，常学辉，张良芝.爱罗咳喘宁汤治疗咳嗽变异性哮喘30例〔J〕．中医研究，2007; 20(5): 35-7.

5谢文英，常学辉，张良芝.爱罗咳喘宁口服液对支气管哮喘患者白细胞介素2及白细胞介素13的影响〔J〕．中医杂志，2007; 48(7): 614-5.

6谢文英，张良芝，刘霖，等.爱罗咳喘宁口服液对慢性支气管炎大鼠白细胞介素-13和肿瘤坏死因子-α含量的影响〔J〕．中国新药杂志，2012; 21(5): 551-4.

7 Mahadeva R，Shapiro SD. Chronic obstructive pulmonary disease: experimental animal models of pulmonary emphysema〔J〕．Thorax，2002; 57: 908-14.

8宋小莲，王昌惠，白冲.脂多糖结合熏烟法和单纯熏烟法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比较〔J〕．第二军医大学学报，2010; 31(3): 246-9.

9宋一平，崔德健，茅培英，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及药物干预的影响〔J〕．中华内科杂志，2000; 39: 556-7.

10胡坚，陈发秀，邱元芝，等.髓过氧化物酶在老年慢性心力衰竭患者中的临床意义〔J〕．中国老年学杂志，2014; 34(1): 13-5.

11 Herfs M，Hubert P，Poirrier AL，et al．Proinflammatory cytokines induce bronchial hyperplasia and squamous metaplasia in smokers: implications for chronic obstructive pulmonary disease therapy〔J〕．Am J Respir Cell Mol Biol，2012; 47(1): 67-79.

12郭式敦，蒋庆贺. COPD的炎症机制〔J〕．山东医药，2010; 50(27): 106-7.

13姚坚，陈金亮，陶一江. COPD患者血清中LTB4和TNF-α的检测及其临床意义〔J〕．临床肺科杂志，2012; 17(3): 459-60.

14 Forte E，Salinas RE，Chang C，et al．The Epstein-Barr virus(EBV)-induced tumor suppressor microRNA MiR-34a is growth promoting in EBV-infected B cells〔J〕．J Virol，2012; 86(12): 6889-98.

15彭红星，杨荣时，曾玉兰，等.吸烟诱导的慢性支气管炎大鼠模型巨噬细胞炎性蛋白-2及髓过氧化物酶研究〔J〕．中国现代医学杂志，2012; 22(12): 10-3.

16 Donnell RO，Peellesc，Ward J，et al．Relationship between peripheral airway dysfunction，airway obstruction and neutrophilic inflammation in COPD〔J〕．Thorax，2004; 59: 837-42.

17茅培英，崔德健，宋一平，等.大鼠吸入烟雾后支气管肺组织ICAM-1及中性粒细胞炎症因子的变化〔J〕．基础医学与临床，2001; 21(3): 222-5.

18 Crul T，Spruit MA. Markers of inflammation and disuse in vastus lateralis of chronic obstructive pulmonary disease patients〔J〕．Eur J Clin Invest，2007; 11(37): 897-904.

19 March TH，Barr EB，Finch GL，et al．Effects of concurrentozone exposure on the pathogenesis of cigarette smoke induced emphysema in B6C3F1 mice〔J〕．Inhal Toxicol，2002; 14(12): 1187-213.

20方苏榕，谷伟，谭焰，等.烟熏联合内毒素构建COPD大鼠模型〔J〕．南京医科大学学报(自然科学版)，2013; 33(9): 1226-30.

〔2014-12-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者:谢文英(1963-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事内科杂病的防治研究。

基金项目:河南省高等学校重点科研项目(15A360030);河南省中医药科学研究专项课题(2013ZY02070);郑州市科技领军人才项目(121PLJRC535)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5705-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 011

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R285. 5