徐 磊,贾玉堂*,赵拴平,于春起,阮永明
(1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽 合肥230031;2.河北福成五丰食品股份有限公司,河北 三河065201)
对于高档牛肉最直观的指标就是大理石花纹、肉色和脂肪颜色这三个方面,这三个指标成为了各个国家牛肉分级的最重要组成部分。1995年Hayes在澳大利亚曾报道过在出口的胴体中黄色脂肪会降低10%的等级,如果有50%的黄脂,每年会减少澳大利亚肉牛业920万美元的收入;我国刘晓牧等在山东省部分屠宰企业的调查,每公斤高档牛肉中,黄色脂肪的肉价格比白色脂肪低40元左右[1]。
牛肉黄脂主要是脂肪组织中的β-胡萝卜素所导致的[2,3],类胡萝卜素是在植物中发现的一组化学复合物,在脂肪中占数量优势的是β-胡萝卜素和叶黄素,胡萝卜素有很多种不同的同质异构体,全反式β-胡萝卜素是在饲料作物中最常见的异构体,也是牛体内循环中主要的类胡萝卜素[4]。近几十年,对可能与牛肉脂肪颜色相关联的候选基因的QTL进行的检测,并没有发现有效的QTL。Kruk的研究认为在Jersey牛β-胡萝卜素的沉积引起黄脂的过程中有一个主效基因在起作用,但却没有找出这个主效基因[5]。由于β-胡萝卜素是牛肉黄脂的主要贡献者,可以对β-胡萝卜素代谢中的酶进行研究来探索牛肉黄脂的遗传机制。
本研究为了研究牛肉脂肪颜色与β-胡萝卜素双脱氧加氢酶(BCO2)基因的关系,选择品种、年龄和饲养条件相似的西门塔尔牛73头,在屠宰时采集组织样品待提取基因组DNA,在胴体排酸48小时后测定皮下脂肪颜色数据。根据已发布的BCO2基因序列设计引物,检测试验牛的BCO2基因的多态性,结合皮下脂肪颜色数据进行相关分析,以检验肉牛BCO2基因多态性与牛肉黄脂肪的关系,为肉牛脂肪颜色等级的分子辅助选择提供科学的理论依据。
在河北三河市福成肉牛养殖场,选择2-3岁西门塔尔牛88头,为同场同样饲养管理条件下育肥肉牛,在福成肉牛屠宰场屠宰时采集新鲜肌肉组织0.5g置75%酒精中-20℃保存待用。胴体排酸48h后,在皮下脂肪切一新鲜切面,用佳能CR-S4w手持式色差仪测色差3次,取平均值。
1.2.1 基因组DNA的提取 使用天根生物的组织基因组DNA提取试剂盒提取,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度,用紫外分光光度计测定其浓度并调整到50ng/μL,-20℃保存备用。
1.2.2 引物合成 根据GenBank公布的BCO2基因序列(登录号:NC_007313),利用Primer5软件设计5对引物,引物由上海銆尚生物技术有限公司合成。引物序列、产物长度、反应条件见表1。
表1
1.2.3 PCR扩增及测序 采用降落式PCR,反应体系均为15μL:含核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer(含15mmol/L的 Mg2+)的 Mix 7.5μL,5mol/μL的混合引物(上下游引物浓度均为10pmol/μL)0.6μL,DNA 模板1μL,ddH2O 5.9 μL。PCR反应程序:95℃预变性5min;94℃变性30s,退火30s(退火温度开始为60℃,每循环降低1℃,10个循环降到50℃后,再以50℃的退火温度进行24个循环),72℃延伸50s;72℃最终延伸10min,4℃保存。
PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后,随机选取20头西门塔尔杂交牛BCO2基因的PCR扩增产物,送至銆尚生物技术有限公司测序,双向测通。
1.2.4 PCR-RFLP检测 测序结果用 DNAStar软件来进行分析校正,用watcut在线工具查找酶切位点,经过查找,用限制性内切酶Bsr1对肉牛BCO2基因P1引物的的PCR产物(525bp)进行酶切,用限制性内切酶ScrFI对肉牛BCO2基因P4引物的的PCR产物(351bp)进行酶切,反应体系均为:PCR产物6μL,10×NEB Buffer 1.5μL,内切酶1μL,双蒸水6.5μL,共15μL。酶切反应温度水浴4h,酶切结束后用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测分型。
1.2.5 数据统计与相关性分析 等位基因频率、基因型频率等数据计算使用PopGene软件计算,运用excel软件对脂肪颜色数据进行整理,并转化为Lab数据,用SAS 9.0(StatisticalAnalysis System)软件的GLM程序对色差数据的b*值与基因型进行相关分析,用最小二乘法根据下列模型进行检验:
Yij=μ+Gi+eij
式中为Yij表型值;μ为群体平均值;Gi为第i种基因效应;eij为随机误差。
色差仪导出的色差值为XYZ数据格式,用excel转化为LBA格式,部分数据结果如下:
注:L*表示亮度,a*表示红度,b*表示黄度,因此在对黄脂进行分析时,本试验采用b*值来代表黄脂的程度。
本研究所采取的西门塔尔杂交牛基因组DNA的提取及BCO2基因各引物的扩增结果良好,可以用于测序和酶切反应。为了检测西门塔尔杂交牛BCO2基因的多态性,随机选取了20份DNA样品的扩增产物进行测序。通过用Clustalx软件对测序结果进行比对,发现2个多态位点:P1产物的第111bp的碱基的A到G的突变;P3产物第76bp的碱基A到G的突变,依次称为标记BV1和标记BV2。
分别对BV1和BV2进行PCR-RFLP鉴定,根据测序结果和酶切鉴定结果发现BV1位点存在3种基因型(GG基因型为391和134bp,AA基因型为391、107和27bp,AG基因型为391、134、107和27bp如图2)。BV2位点存在3种基因型(II基因型为138、126和56bp,WW基因型为194和126 bp,IW 基因型为194、138、126和56bp,如图3)。
图4 BV1位点RFLP检测结果电泳图
图5 BV2位点RFLP检测结果电泳图
在实验群体中,对BCO2基因BV1位点的检测结果表明,G等位基因是优势基因,而A等位基因频率较低,BV1位点W等位基因为优势基因。(见表2、表3)。
表2 两位点各基因型及频率
表3 两位点的遗传多样性分析
西门塔尔杂交牛BCO2基因的BV1标记不同基因型对肉牛脂肪颜色影响的关联分析中,AA基因型肉牛脂肪颜色最小二乘均值为21.168,GG基因型为16.599,显著极显著(P<0.01),可以判断BCO2基因的多态性对脂肪颜色有显著的影响,其中BV1的AA基因型容易导致黄脂,而GG基因型牛脂肪颜色得分较高。(见表4)。
表4 BCO2基因BV1标记不同基因型与脂肪颜色色差数据中b*值最小二乘分析结果
西门塔尔杂交牛BCO2基因的BV2标记不同基因型对肉牛脂肪颜色影响的关联分析中,II基因型肉牛脂肪颜色最小二乘均值为15.425,WW基因型为14.048,差异不显著(P>0.05),这表明脂肪颜色在BV2的三种基因型间差异不显著。(见表5)。
表5 BCO2基因BV1标记不同基因型与脂肪颜色色差数据中b*值最小二乘分析结果
在动物体内,β-胡萝卜素氧化合成为维生素A有两种方式:对称裂解和非对称裂解。对称裂解由β,β-胡萝卜素15,15'-加氧酶(BCMO1)催化,生成视黄醛和维甲酸;非对称裂解是由β-胡萝卜素9',10'-双加氧脱氢酶(BCO2)催化,产生β-紫罗酮和两分子的β-阿朴胡萝卜素醛。在脊椎动物中,维生素A衍生物的生物合成中,β-胡萝卜素的哪种裂解是主要方式也是一个长期争论的话题[6],结果表明,BCO2酶对β-胡萝卜素有降解作用,与β-胡萝卜素在脂肪中的沉积浓度有关系[7,8],同时BCO2基因的表达与β-胡萝卜素的沉积也有高度的相关性。这说明调控维生素A合成通路的BCO2基因的表达水平对β-胡萝卜素在皮下脂肪组织中的沉积有重要的影响作用,它们也就可能影响牛肉的脂肪颜色。通过RT-PCR研究,发现在鼠的肠、肝、肾和睾丸组织中的表达水平高度稳定,在脾、脑、心脏和肺组织表达水平很低[9],VonLintig等[10]在人体的骨骼肌中也发现了BCO2基因的mRNA。在敲除了BCMO1基因的小鼠体内,内脏脂肪中BCO2的mRNA表达水平却没有变化,Hessel等[11]在已经检测过没有BCMO1酶活力的情况下,维生素A缺乏不会影响BCO2酶在人体的不同的组织和细胞中的表达[12]。这些结果表明调控维生素A和乳酸合成通路的基因的表达水平对β-胡萝卜素在皮下脂肪组织中的沉积有重要的影响作用,它们也就能影响牛肉的脂肪颜色[13]。
本研究利用直接测序和PCR-RFLP技术研究了西门塔尔牛BCO2基因的变异,分析了其与牛脂肪颜色性状的关系。在BCO2基因上发现2个突变位点,分别命名为BV1、BV2。在两个位点都各有三种基因型,且都以GG型为主。在关联分析中发现BV1位点与肉牛皮下脂肪颜色具有显著相关性,其三种基因型的牛肉脂肪颜色差异显著(P<0.01),AA基因型脂肪黄脂得分较高。
通过本研究和国内外其他的研究可以看出BCO2基因与西门塔尔肉牛脂肪颜色有著关联性,因此本研究认为BCO2基因可以作为与肉牛脂肪颜色性能有关的候选基因。在肉牛育种实践中,可利用BCO2基因作为分子标记经行人工选择降低群体中劣势基因型个体的比例,以提脂肪颜色等级,改善牛肉等级。本研究检测了到了与肉牛脂肪颜色性能相关的标记BV1,此变异位点可以作为分子标记而应用,可以提高肉牛脂肪颜色等级的辅助选择的分子标记。
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