西门塔尔牛BCO2基因多态性及与脂肪颜色性状的相关性研究

徐 磊，贾玉堂＊，赵拴平，于春起，阮永明

（1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥230031；2.河北福成五丰食品股份有限公司，河北 三河065201）

对于高档牛肉最直观的指标就是大理石花纹、肉色和脂肪颜色这三个方面，这三个指标成为了各个国家牛肉分级的最重要组成部分。1995年Hayes在澳大利亚曾报道过在出口的胴体中黄色脂肪会降低10%的等级，如果有50%的黄脂，每年会减少澳大利亚肉牛业920万美元的收入；我国刘晓牧等在山东省部分屠宰企业的调查，每公斤高档牛肉中，黄色脂肪的肉价格比白色脂肪低40元左右［1］。

牛肉黄脂主要是脂肪组织中的β－胡萝卜素所导致的［2，3］，类胡萝卜素是在植物中发现的一组化学复合物，在脂肪中占数量优势的是β－胡萝卜素和叶黄素，胡萝卜素有很多种不同的同质异构体，全反式β－胡萝卜素是在饲料作物中最常见的异构体，也是牛体内循环中主要的类胡萝卜素［4］。近几十年，对可能与牛肉脂肪颜色相关联的候选基因的QTL进行的检测，并没有发现有效的QTL。Kruk的研究认为在Jersey牛β－胡萝卜素的沉积引起黄脂的过程中有一个主效基因在起作用，但却没有找出这个主效基因［5］。由于β－胡萝卜素是牛肉黄脂的主要贡献者，可以对β－胡萝卜素代谢中的酶进行研究来探索牛肉黄脂的遗传机制。

本研究为了研究牛肉脂肪颜色与β－胡萝卜素双脱氧加氢酶（BCO2）基因的关系，选择品种、年龄和饲养条件相似的西门塔尔牛73头，在屠宰时采集组织样品待提取基因组DNA，在胴体排酸48小时后测定皮下脂肪颜色数据。根据已发布的BCO2基因序列设计引物，检测试验牛的BCO2基因的多态性，结合皮下脂肪颜色数据进行相关分析，以检验肉牛BCO2基因多态性与牛肉黄脂肪的关系，为肉牛脂肪颜色等级的分子辅助选择提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在河北三河市福成肉牛养殖场，选择2－3岁西门塔尔牛88头，为同场同样饲养管理条件下育肥肉牛，在福成肉牛屠宰场屠宰时采集新鲜肌肉组织0.5g置75%酒精中－20℃保存待用。胴体排酸48h后，在皮下脂肪切一新鲜切面，用佳能CR－S4w手持式色差仪测色差3次，取平均值。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 使用天根生物的组织基因组DNA提取试剂盒提取，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度，用紫外分光光度计测定其浓度并调整到50ng／μL，－20℃保存备用。

1.2.2 引物合成 根据GenBank公布的BCO2基因序列（登录号：NC＿007313），利用Primer5软件设计5对引物，引物由上海銆尚生物技术有限公司合成。引物序列、产物长度、反应条件见表1。

表1

1.2.3 PCR扩增及测序 采用降落式PCR，反应体系均为15μL：含核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer（含15mmol／L的 Mg2＋）的 Mix 7.5μL，5mol／μL的混合引物（上下游引物浓度均为10pmol／μL）0.6μL，DNA 模板1μL，ddH2O 5.9 μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s（退火温度开始为60℃，每循环降低1℃，10个循环降到50℃后，再以50℃的退火温度进行24个循环），72℃延伸50s；72℃最终延伸10min，4℃保存。

PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，随机选取20头西门塔尔杂交牛BCO2基因的PCR扩增产物，送至銆尚生物技术有限公司测序，双向测通。

1.2.4 PCR－RFLP检测 测序结果用 DNAStar软件来进行分析校正，用watcut在线工具查找酶切位点，经过查找，用限制性内切酶Bsr1对肉牛BCO2基因P1引物的的PCR产物（525bp）进行酶切，用限制性内切酶ScrFI对肉牛BCO2基因P4引物的的PCR产物（351bp）进行酶切，反应体系均为：PCR产物6μL，10×NEB Buffer 1.5μL，内切酶1μL，双蒸水6.5μL，共15μL。酶切反应温度水浴4h，酶切结束后用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测分型。

1.2.5 数据统计与相关性分析 等位基因频率、基因型频率等数据计算使用PopGene软件计算，运用excel软件对脂肪颜色数据进行整理，并转化为Lab数据，用SAS 9.0（StatisticalAnalysis System）软件的GLM程序对色差数据的b＊值与基因型进行相关分析，用最小二乘法根据下列模型进行检验：

Yij＝μ＋Gi＋eij

式中为Yij表型值；μ为群体平均值；Gi为第i种基因效应；eij为随机误差。

2 结果与分析

2.1 脂肪颜色检测结果

色差仪导出的色差值为XYZ数据格式，用excel转化为LBA格式，部分数据结果如下：

注：L＊表示亮度，a＊表示红度，b＊表示黄度，因此在对黄脂进行分析时，本试验采用b＊值来代表黄脂的程度。

2.2 RFLP分析结果

本研究所采取的西门塔尔杂交牛基因组DNA的提取及BCO2基因各引物的扩增结果良好，可以用于测序和酶切反应。为了检测西门塔尔杂交牛BCO2基因的多态性，随机选取了20份DNA样品的扩增产物进行测序。通过用Clustalx软件对测序结果进行比对，发现2个多态位点：P1产物的第111bp的碱基的A到G的突变；P3产物第76bp的碱基A到G的突变，依次称为标记BV1和标记BV2。

分别对BV1和BV2进行PCR－RFLP鉴定，根据测序结果和酶切鉴定结果发现BV1位点存在3种基因型（GG基因型为391和134bp，AA基因型为391、107和27bp，AG基因型为391、134、107和27bp如图2）。BV2位点存在3种基因型（II基因型为138、126和56bp，WW基因型为194和126 bp，IW 基因型为194、138、126和56bp，如图3）。

图4 BV1位点RFLP检测结果电泳图

图5 BV2位点RFLP检测结果电泳图

2.3 BCO2基因标记的多态性分析

在实验群体中，对BCO2基因BV1位点的检测结果表明，G等位基因是优势基因，而A等位基因频率较低，BV1位点W等位基因为优势基因。（见表2、表3）。

表2 两位点各基因型及频率

表3 两位点的遗传多样性分析

2.4 关联分析结果

西门塔尔杂交牛BCO2基因的BV1标记不同基因型对肉牛脂肪颜色影响的关联分析中，AA基因型肉牛脂肪颜色最小二乘均值为21.168，GG基因型为16.599，显著极显著（P＜0.01），可以判断BCO2基因的多态性对脂肪颜色有显著的影响，其中BV1的AA基因型容易导致黄脂，而GG基因型牛脂肪颜色得分较高。（见表4）。

表4 BCO2基因BV1标记不同基因型与脂肪颜色色差数据中b＊值最小二乘分析结果

西门塔尔杂交牛BCO2基因的BV2标记不同基因型对肉牛脂肪颜色影响的关联分析中，II基因型肉牛脂肪颜色最小二乘均值为15.425，WW基因型为14.048，差异不显著（P＞0.05），这表明脂肪颜色在BV2的三种基因型间差异不显著。（见表5）。

表5 BCO2基因BV1标记不同基因型与脂肪颜色色差数据中b＊值最小二乘分析结果

3 讨论

在动物体内，β－胡萝卜素氧化合成为维生素A有两种方式：对称裂解和非对称裂解。对称裂解由β，β－胡萝卜素15，15＇－加氧酶（BCMO1）催化，生成视黄醛和维甲酸；非对称裂解是由β－胡萝卜素9＇，10＇－双加氧脱氢酶（BCO2）催化，产生β－紫罗酮和两分子的β－阿朴胡萝卜素醛。在脊椎动物中，维生素A衍生物的生物合成中，β－胡萝卜素的哪种裂解是主要方式也是一个长期争论的话题［6］，结果表明，BCO2酶对β－胡萝卜素有降解作用，与β－胡萝卜素在脂肪中的沉积浓度有关系［7，8］，同时BCO2基因的表达与β－胡萝卜素的沉积也有高度的相关性。这说明调控维生素A合成通路的BCO2基因的表达水平对β－胡萝卜素在皮下脂肪组织中的沉积有重要的影响作用，它们也就可能影响牛肉的脂肪颜色。通过RT－PCR研究，发现在鼠的肠、肝、肾和睾丸组织中的表达水平高度稳定，在脾、脑、心脏和肺组织表达水平很低［9］，VonLintig等［10］在人体的骨骼肌中也发现了BCO2基因的mRNA。在敲除了BCMO1基因的小鼠体内，内脏脂肪中BCO2的mRNA表达水平却没有变化，Hessel等［11］在已经检测过没有BCMO1酶活力的情况下，维生素A缺乏不会影响BCO2酶在人体的不同的组织和细胞中的表达［12］。这些结果表明调控维生素A和乳酸合成通路的基因的表达水平对β－胡萝卜素在皮下脂肪组织中的沉积有重要的影响作用，它们也就能影响牛肉的脂肪颜色［13］。

本研究利用直接测序和PCR－RFLP技术研究了西门塔尔牛BCO2基因的变异，分析了其与牛脂肪颜色性状的关系。在BCO2基因上发现2个突变位点，分别命名为BV1、BV2。在两个位点都各有三种基因型，且都以GG型为主。在关联分析中发现BV1位点与肉牛皮下脂肪颜色具有显著相关性，其三种基因型的牛肉脂肪颜色差异显著（P＜0.01），AA基因型脂肪黄脂得分较高。

4 结论

通过本研究和国内外其他的研究可以看出BCO2基因与西门塔尔肉牛脂肪颜色有著关联性，因此本研究认为BCO2基因可以作为与肉牛脂肪颜色性能有关的候选基因。在肉牛育种实践中，可利用BCO2基因作为分子标记经行人工选择降低群体中劣势基因型个体的比例，以提脂肪颜色等级，改善牛肉等级。本研究检测了到了与肉牛脂肪颜色性能相关的标记BV1，此变异位点可以作为分子标记而应用，可以提高肉牛脂肪颜色等级的辅助选择的分子标记。

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