生物肥料生产菌株对有机磷农药降解能力的比较研究

王笑庸，牛彦波.2，殷博,2，安琦,2，吴皓琼,2

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150090）

生物肥料生产菌株对有机磷农药降解能力的比较研究

王笑庸1，牛彦波1.2，殷博1,2，安琦1,2，吴皓琼1,2

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150090）

比较了20株生物肥料生产菌对有机磷农药的降解能力，经反复驯化，确定P05解磷蜡样芽孢杆菌（Bacillus Cereus）和SbM10解磷枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）2株菌具有较强的降解有机磷农药乐果、氧乐果的能力。

生物肥料；菌株；降解；有机磷农药

有机磷农药在我国应用最多最普遍，占据农药市场的70%以上份额，是目前农业生产环境中最严重的污染源之一。作为治理农药残留的众多技术之一，微生物技术以安全环保、经济高效的特性一直是关注研究的热点。有机磷农药降解微生物的筛选方法较多，目前最常用的是从接触有机磷农药的土壤或者底泥中采集样品，经富集培养、驯化或诱变等获取高效降解菌株。由于是在实验条件下液体纯培养条件下开展研究，与田间应用存在较大差异，限制了农药降解菌实际应用[1-2]。故此，本项目组选择20株生物肥料生产菌作为筛选对象，以乐果为靶目标，通过驯化，比较各菌株降解有机磷农药的能力，旨在探寻生物肥料作为农药降解菌剂在实际应用中的可能性。

1　材料

1.1菌种

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P01-P04；蜡样芽孢杆菌（Bacillus Cereus）P05-08；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SbM09-10；侧孢芽孢杆菌（Bacillus Laterospore）P11；克雷伯氏菌(Klebsiella)P12；硅酸盐细菌（Bacillusmucilaginosus）K01-08。共20株菌，皆有解磷作用，作为解磷菌或解钾细菌应用于微生物肥料的生产，项目组分离，保藏。

1.2培养基

选择培养基：无机盐培养基A（NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2SO 4·7H2O 0.5g，CaCl20.1g，FeSO40.01g，MnSO40.001g，H2O 1 000 mL）和无机盐培养基B（K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，CaCl20.1g，MnSO40.001g，FeSO40.001g，（NH4）2SO4 1.0g,H2O 1 000 mL）；

分离、富集培养：LB肉汤培养基、Ashby固氮培养基、PDA土豆汁培养基。

1.3试剂

实验所用试剂皆为分析纯。

2　试验内容和方法

2.1菌株的驯化

挑取2～3环菌苔于40mL无机盐培养基A中，依5‰比例加入乐果，30℃、180r/min，培养48～72h。观察培养液的浑浊度，判断菌株是否有存活生长，同时在LB肉汤培养基或Ashby固氮培养基划线分离，挑取单菌落，复接于5‰乐果的无机盐培养基A中，30℃培养，进行驯化，反复3次，选择生长旺盛的菌株，保存。

2.2菌株的复筛

将驯化的菌株接于40mL无机盐培养基B中，依5‰比例加入乐果，30℃、180r/min培养48h。吸取5mL转接于新鲜的无机盐培养基B中，依7‰～9‰比例加入乐果，培养并判断菌株是否存活、生长，同时在含7‰乐果的无机盐培养基B和PDA土豆汁培养基上划线培养，选择生长好的菌株，进行降解能力的比较。

2.3菌株降解有机磷农药能力的比较

将复筛优选的4株菌活化18h后，接种于含5‰乐果的无机盐培养基B中，培养72h。于发酵液加入适量的无磷活性炭脱色，12 000r/min低温离心，取上清液2～10mL（含5～25mg磷）进行无机磷含量的测定，以确定降解有机磷农药效果最好的菌株。采用钼锑钪比色法进行无机磷含量的测定，方法参见-2000磷细菌肥料。不接菌的培养液作对照(CK)。

2.4复筛菌株P05、SbM 10菌株降解乐果、氧化乐果的能力分析

将复筛菌株接种于LB培养基中，培养24h至对数生长期，按1%比例分别接种于无机盐培养基B和LB中，按2‰～8‰比例分别加入不同量乐果和氧化乐果，培养48～72h测定培养液中农药残留量，计算降解率。乐果、氧化乐果含量测定：取发酵液10mL，加入20 mL乙腈、2gNacl充分震荡，静止30min，取10mL有机相，80℃水浴蒸发至干，加10mL丙酮溶解，气象色谱测定。测定方法见中国农业行业标准NY/T 761-2008。

3　结果与分析

3.1菌株的驯化与复筛

在以乐果作为唯一碳源和能源的无机盐培养基中，各菌经过3次驯化，除2株菌（蜡状芽孢杆菌P06、P08）不能利用乐果生长外，其余18株菌，皆能生长。复筛结果见表1。可见，硅酸盐细菌（钾细菌）没有降解有机磷农药的能力；解磷巨大芽孢杆菌P03、蜡状芽孢杆菌P05、枯草芽孢杆菌SbM09、SbM10 4株菌生长最好，说明能利用乐果生长。

3.2菌株降解能力的比较

结果见表2。从表2可见，SbM-10的枯草孢杆菌和P05蜡样芽孢杆菌对乐果的降解能力最强，降解产物无机磷的含量分别达到0.413mg/L、0.45 mg/L，故选择这2株菌开展深入研究。

表1　复筛菌株生长状况Tab.1 Secondary screening of strains growth conditions

表2　4株菌降解能力比较Tab.2 Comparison of 4 strains degradation Ability

3.3复筛菌株P05、SbM-10降解乐果、氧化乐果的能力分析

结果见图1。从图1可知，在含2‰～8‰乐果浓度的无机盐培养基B中，培养48h,SbM 10、P05对乐果降解率分别为85.6%～93.08%和75.77%～91.59%；随着农药浓度的增加，菌的生长受到抑制；氧化乐果的降解试验结果见表3。从表3可知，这2株菌对氧化乐果均有明显的降解能力，72h测定，在含乐果2‰、4‰无机盐培养基B中，SbM10和P05对氧化乐果的降解率分别是79.78%、73.59%和63.55%、79.89%；在LB中前者高达91.49%～84.97%，后者达93.12%～75.54%。菌株在LB培养基中生长数量远高于无机盐培养基，说明在富营养条件下，菌株对农药的抗性增加，降解农药的效果更佳。

图1　在无机盐B中菌株对乐果的降解效果Fig.1Strains degradation effects on dimethoate in inorganic salt medium B

表3　菌株在无机盐B及LB肉汤培养基中对氧化乐果的降解效果Tab.3 The degradation rate of strains in inorganic salt medium B and LB broth medium to omethoate

4　结论与讨论

本项目以微生物肥料生产菌（解磷细菌、硅酸盐细菌）作为筛选对象，优选出2株具有较高降解能力的菌株：P05解磷蜡样芽孢杆菌和SbM-10解磷枯草芽孢杆菌，对有机磷农药和氧化乐果都有较强的降解能力，优于或等同于目前文献报道的其他菌株的降解能力［2-8］；为生物肥料在农药降解上的应用提供理论依据，将进一步对有关上述2株菌的降解机理以田间应用情况加以深入研究。

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［2］王圣慧，张琛，闫艳春.有机磷农药微生物降解的研究进展［J］.生物技术，2006，16（3）：95-98.

［3］李玉梅，王根林，于洪久，等.大豆杀虫剂氧化乐果降解菌的分离［J］.大豆科学，2009，（28）：126-129.

［4］马丽娜，官雪芳，朱育菁，等.乐果降解茵的分离、筛选和鉴定［J］.中国农学通报，2008，24（7）：441-444.

［5］高小朋，郑荣，苏翠翠，等.陕北地区土壤中残留农药——氧化乐果高效降解菌的筛选［J］.安徽农业科学，2009，37（3）：1317-1318.

［6］颜世雷，陶玉贵，潘军，等.氧化乐果降解茵的分离与初步鉴定［J］.中国土壤与肥料，2007，（06）：77-79.

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Comparative Study of Bio-fertilizer Production Strains to Organophosphorus Pesticide Degradation Ability

WANGXiao-yong1;NIUYan-bo1.2;YINBo1.2,ANQi1.2,WUHao-qiong1.2
(1.Institute ofMicrobiology,HAS.,Harbin 150010,China;
2.Institute ofAdvanced Technology,HAS.,Harbin 150090,China)

The study has compared the degradation ability of 20 production strains of bio-fertilizer production to organophosphorus pesticide. After repeated domesticated,the study concluded that 2 strains of P05 phosphate solubilizingBacillusCereus and SbM10 phosphate solubilizing Bacillussubtilis had a strongdegradation abilitytoOrganophosphorus pesticide dimethoate and omethoate.

Bio-fertilizer;Strain;Degradation;Organophosphorus pesticide

X172

A

1674-8646（2015）09-0026-03

2015-06-12

黑龙江省院所基本技术研究专项“有机磷农药降解菌剂在温（棚）室蔬菜上的应用研究”（SW201314）

王笑庸（1975-），女，黑龙江大庆人，硕士，工程师，从事科技管理工作。

吴皓琼（1968-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，研究员，从事农业微生物研发工作，e-mail：wuhaoqiong@163.com。