肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6在侵袭性垂体瘤中的表达①

吴建龙，乔建勇，段庆华

肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6在侵袭性垂体瘤中的表达①

吴建龙1a，乔建勇1b，段庆华1a

目的研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)在侵袭性垂体瘤(IPA)中的表达。方法采用免疫组织化学方法(SP法)检测40例IPA和40例非侵袭性垂体瘤(NIPA)组织中TNF-α和IL-6的表达。结果TNF-α、IL-6在IPA组织中的表达均高于NIPA(P＜0.05)。结论TNF-α、IL-6可能在IPA的发生、发展过程发挥作用。

侵袭性垂体瘤；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6

[本文著录格式]吴建龙，乔建勇，段庆华.肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6在侵袭性垂体瘤中的表达[J].中国康复理论与实践,2015,21(4):432-435.

CITED AS:Wu JL,Qiao JY,Duan QH.Expression of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in invasive pituitary adenoma[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):432-435.

垂体瘤是颅内常见肿瘤之一，起源于垂体前叶细胞，人群发病率约为1/10万～7/10万，仅次于脑膜瘤和脑胶质瘤，约占所有颅内肿瘤的10%[1]。大部分垂体瘤的生长方式与一般良性肿瘤相似，呈局限性生长，一般不发生远处转移，若手术全切除，预后良好；有些垂体瘤的生长方式与恶性肿瘤相似，可以向鞍区周围呈侵袭性生长，突破包膜，超过垂体窝，生长到蝶窦、海绵窦和前颅窝底、斜坡、下丘脑等其他部位，鞍区周围结构被破坏，导致手术很难完全切除，术后复发率高[2]。有人根据垂体腺瘤的生长行为将其分为非侵袭性垂体瘤(non-invasive pituitary adenomas,NIPA)、侵袭性垂体瘤(invasive pituitary adenomas,IPA)和垂体癌。IPA在组织学上属良性肿瘤，但已具有恶性倾向的生物学行为[3]。Jefferson提出的IPA概念[4]被广泛接受，可以很好地解释其不能完全切除，复发率高的原因。目前关于肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的研究很多。本研究观察IPA组织中TNF-α和IL-6的表达，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究标本

收集承德市中心医院和承德医学院附属医院2012年10月～2014年6月手术切除经病理证实的垂体瘤标本。Wilson-Hardy分类3～4级，术前MRI和术中发现肿瘤侵袭鞍区周围组织，如海绵窦、鞍底周围骨质等，为侵袭性垂体腺瘤。按此标准确定的IPA和NIPA各40例。所有标本均经4%中性甲醛充分固定。

1.2 主要试剂和设备

1.2.1 主要试剂

鼠抗人TNF-α多克隆IgG抗体、鼠抗人IL-6多克

隆IgG抗体：美国圣克鲁斯生物技术公司。即用型快捷鼠免疫组化试剂盒、DAB显色试剂、山羊血清：北京中杉金桥生物技术公司。二甲苯、酒精、3%过氧化氢、甲醇、PBS、枸橼酸盐缓冲液、苏木素、氨水、中性树胶。

1.2.2 主要设备

CSR-1-30型超纯水机：北京爱思泰克公司。37℃恒温培养箱：上海精弘实验设备公司。微量移液器：EPPENDORF公司。全自动脱水机、石蜡切片机、生物组织包埋机：LEICA公司。BX43显微镜：OLYMPUS公司。显微照相系统：厦门MOTIC公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色

将垂体瘤组织标本放入10%中性福尔马林溶液中充分固定24 h。取大小合适的组织块。梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，石蜡切片机切片，厚4 μm。薄片摊片机摊平，贴至载坡片上，置80℃烤箱中15 min脱蜡。HE染色，盖玻片封片。

1.3.2 免疫组织化学染色

石蜡切片捞片于处理好的载玻片上，置60℃烤箱中2 h。脱蜡、脱苯至蒸馏水。3%H2O2-甲醇溶液37℃浸10 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。入沸腾的0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)1.5 min，冷却15 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。滴加山羊血清，37℃温箱孵育15 min，不冲洗。滴加浓度1∶100鼠抗人多克隆一抗，4℃过夜，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。滴加抗鼠生物素化二抗，37℃温箱孵育20 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

免疫组化染色阴性对照用PBS代替，阳性对照由试剂公司提供的阳性切片代替。

TNF-α和IL-6阳性表达水平采用阳性细胞百分比和染色强度评分之和综合判定。①选组织切片中肿瘤细胞密集区显微镜下观察(10×20)，随机选取5个视野：阳性细胞数＜10%为0分，10%～25%为1分，25%～50%为2分，≥50%为3分。②阳性染色强度评分：无色为0分，淡棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色或棕褐色为3分。以①+②之和判定结果：0分为阴性(-)，1～2分为低表达(+)，3～4分为中度表达(2+)，5～6分为高表达(3+)。

1.4 统计学分析

应用SPSS 19.0统计软件进行χ2检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色

IPA表现为多细胞性，并可见有丝分裂活动，细胞核仁明显，间质血管密度相对较高。NIPA以上表现不明显。见图1。

2.2 TNF-α

IPA组织中，TNF-α阳性率65%；NIPA组织中，阳性率25%(P＜0.05)。见表1和图2。

表1 TNF-α在IPA和NIPA组织中的阳性表达(n)

2.3 IL-6

IPA组织中，IL-6阳性率为67.5%；NIPA组织中，IL-6阳性率22.5%(P＜0.05)。见表2和图3。

表2 IL-6在IPA和NIPA组织中的阳性表达(n)

3 讨论

3.1 TNF-α与IPA

TNF-α也称为恶病质素，是一种小分子蛋白，由巨噬细胞/单核细胞活化分泌，在炎症反应、细胞免疫、肿瘤免疫等多种生理和病理过程当中发挥关键作用[5]。早在1993年，Komori等发现，TNF-α与冈田酸具有相似的作用，它们可以刺激成纤维细胞波形蛋白和热休克蛋白27磷酸化，而且TNF-α的这种效果要超过冈田酸1000倍，这些磷酸化蛋白是一种肿瘤促进剂，两者均可引起肿瘤的发展[6]。TNF-a在肿瘤形成中发挥着重要的作用[7]。

3.1.1 促进垂体瘤血管生成

肿瘤组织侵袭性生长依赖肿瘤血管的形成。TNF-α可以促进IL-8 mRNA和IL-8蛋白表达，从而促进内皮细胞增殖，对肿瘤血管生成是一个关键步骤[8]。血管生成后，IL-8通过激活血管内皮细胞的G蛋白，形成肌动蛋白张力丝，使细胞回缩，从而使血管内皮细胞之间的间隙增加，导致新生血管通透性增强，进一步使肿瘤细胞的侵袭性增强[9]。

图1 IPA和NIPA组织学观察(HE染色,200×)

图2 IPA和NIPA组织TNF-α表达(免疫组织化学染色,200×)

图3 IPA和NIPA组织IL-6表达(免疫组织化学染色,200×)

TNF-α可以促进基质金属蛋白酶(matrix meta lloprote inases,MMPs)的表达。MMPs通过降解细胞外基质参与肿瘤血管形成，为垂体瘤的侵袭性生长提供更加有利条件。

3.1.2 增强垂体瘤细胞的侵袭性

TNF-α有助于肿瘤细胞和内皮细胞黏附。TNF-α可以在转录水平使CD44v6蛋白在肿瘤细胞中的表达，且可提高CD44v6和其特定的配体透明质酸(hyaluron icacid,HA)的黏附能力。透明质酸可在多种细胞和细胞外基质表达，因此可以使肿瘤细胞很容易与细胞外基质黏附，使肿瘤细胞的侵袭能力增强[10]，从而促进IPA的发展。

3.1.3 减少细胞受免疫细胞攻击的机会

TNF-α可以使整合素的表达上调，特别是整合素A3、A4、β1。一方面，P-、E-选择素可直接促进肿瘤细胞和血管内皮黏附；另一方面，P-选择素和整合素也可以介导血小板活化，从而使活化血小板结合肿瘤细胞，削弱免疫细胞对肿瘤细胞的攻击，从而引起肿瘤的侵袭性生长[11-12]。

3.2 IL-6与IPA

Weissenbach在1980年最早发现IL-6，并命名为干扰素β2。随着研究不断深入，IL-6被越来越多的学者发现，先后被命名为浆细胞瘤/杂交瘤生长因子、肝细胞刺激因子、B细胞生长因子等。等到这些细胞因子逐渐被克隆出后，才正式命名为IL-6。

IL-6参与免疫反应、细胞增殖和血细胞的分化调控，是迄今发现的功能最广泛的因子之一，能多种细胞分泌。

最早将IL-6作为炎性因子研究。其后越来越多的研究发现IL-6参与了肿瘤发生、发展、侵袭和转移的过程[13]。有研究认为，IL-6与垂体腺瘤的侵袭性生长有关[14]。高表达的IL-6与其异常的信号通路可促进肿瘤的发生、发展，并且与多种肿瘤患者的不良预后正相关[15-16]。

IL-6同样可以促进肿瘤血管的生成。Nilsson等报道，卵巢癌细胞在体外并不都表达IL-6，但裸鼠接种卵巢癌细胞后，所有细胞均有IL-6和IL-6受体高表达；IL-6还能趋化血管内皮细胞，从而促进新生血管形成[17]。刘远杨等报道，垂体腺瘤可能通过分泌IL-6，调节、促进肿瘤新生血管的形成，从而造成垂体腺瘤的侵袭性生长[18]。目前认为其机制可能为IL-6通过与其受体结合，激活肿瘤细胞内的JAK/STAT信号通路和Ras/Erk信号通路，从而使肿瘤细胞分泌过量的血管内皮生长因子，促进肿瘤新生血管的形成[19]。

侵袭性是影响肿瘤恶性程度的主要因素。Kanazawa等发现，IL-6可直接影响肿瘤侵袭和肿瘤细胞增殖，因而使肿瘤更富有侵袭性[20]。IPA在组织学上表现为细胞有丝分裂增加，生物学行为上表现为侵袭性生长，而NIPA此特征则不明显。随着对IL-6在肿瘤中的作用的不断研究，目前已有报道拮抗IL-6的单克隆抗体药物在临床试验中被用于治疗肿瘤[21]。

综上所述，本研究提示，TNF-α和IL-6的高表达可以促进垂体瘤的侵袭性生长。

[1]王忠诚.王忠诚神经外科学[M].武汉:湖北科学技术出版社,2005: 620.

[2]Roelfsema F,Biermasz NR,Pereira AM.Clinical factors involved in the recurrence of pituitary adenomas after surgical remission:a structured review and meta-analysis[J].Pituitary,2012,15(1):71-83.

[3]Rey LA.A case of pituitarty adenoma with 58 chromosomes[J].Cancer Genet Cytogenet,1986,23(2):171.

[4]Jefferson G.Extrasellar extensions of pituitary adenomas:(Section of Neurology)[J].Proc R Soc Med,1940,33(7):433-458.

[5]崔力芳,郭晓静,付丽.TNF-α与肿瘤发生发展关系的研究进展[J].中华乳腺病杂志,2007,6(1):71-77.

[6]Komori A,Yatsunami J,Suganuma M,et al.Tumor necrosis factor acts as a tumor promoter in BALB/3T3 cell transformation[J].Cancer Res, 1993,53(9):1982-1985

[7]Suganuma M,Okabe S,Marino MW,et al.Essential role of tumor necrosis factor alpha in tumor promotion as revealed by TNF-alpha-deficient mice[J].Cancer Res,1999,59(18):4516-4518.

[8]Berry KK,Varney ML,Dave BJ,et al.Expression of interleukin-8 in human metastatic endometrial carcinoma cells and its regulation by inflammatory cytokines[J].Int J Gynecol Cancer,2001,11(1):54-60

[9]Han YP,Tuan TL,Wu H,et al.TNF-alpha stimulates activation of pro-MMP2 in human skin through NF-(kappa)B mediated induction of MT1-MMP[J].J Cell Sci,2001,114(Pt 1):131-139.

[10]Barshishat M,Ariel A,Cahalon L,et al.TNF-alpha and IL-8 regulate the expression and function of CD44 variant proteins in human colon carcinoma cells[J].Clin Exp Metastasis,2002,19(4):327-337.

[11]Chen M,Geng JG.P-selectin mediates adhesion of leukocytes,platelets,and cancer cells in inflamation,thrombosis,and cancer growth and metastasis[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2006,54(2):75-84.

[12]Zhu N,Eves PC,Katerinaki E,et al.Melanoma cell attachment,invasion,and integrin expression is upregulated by tumor necrosis factor alpha and suppressed by alpha melanocyte stimulating hormone[J].J Invest Dematol,2002,119(5):1165-1171.

[13]刘徽,朱波,林治华.IL-6信号通路与肿瘤[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,27(3):353-355.

[14]邹自英,朱冰,胡娟,等.垂体腺瘤细胞VEGF表达与IL-1α和IL-6分泌的关系[J].西南国防医药,2008,18(1):30-32.

[15]Hodge DR,Hurt EM,Farrar WL.The role of IL-6 and STAT3 in inflammation and cancer[J].Eur J Cancer,2005,41(16):2502-2512.

[16]Tchirkov A,Khalil T,Chautard E,et al.Interleukin-6 gene amplification and shortened survival in glioblastoma patients[J].Br J Cancer, 2007,96(3):474-476.

[17]Nilsson MB,Langley RR,Fidler IJ.Interleukin-6,secreted by human ovarian carcinoma cells,is a potent proangiogenic cytokine[J].Cancer Res,2005,65(23):10794-10800.

[18]刘远杨,周嘉彬,汪凯,等.IL-6与垂体腺瘤微血管密度及侵袭性的相关性研究[J].中国微侵袭神经外科杂志,2014,19(9):424-426.

[19]Hong DS,Angelo LS,Kurzrock R.Interleukin-6 and its receptor in cancer:implications for translational therapeutic[J].Cancer,2007,110 (9):1911-1928.

[20]Kanazawa T,Nishino H,Hasegawa M,et al.Interleukin-6 directly influences proliferation and invasion potential of head and neck cancer cells[J].EurArch Otorhinolaryngol,2007,264(7):815-821.

[21]Fulciniti M,Hideshima T,Vermot-Desroches C,et al.A high-affinity fully human anti-IL-6 mAb,1339,for the treatment of multiple myeloma[J].Clin Cancer Res,2009,15(23):7144-7152.

Expression of Tumor Necrosis Factor-α and Interleukin-6 in Invasive PituitaryAdenoma

WU Jian-long1a,QIAO Jian-yong1b,DUAN Qing-hua1a
1.a.Department of Pathology;b.Department of Neurosurgery,Chengde Central Hospital,Chengde,Hebei 067000,China

Objective To study the tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)expressed in invasive pituitary adenomas (IPA).Methods The expression of TNF-α and IL-6 were observed with immunohistochemstry(SP approach)in tissue from 40 cases of non-invasive pituitary adenomas(NIPA)and 40 cases of IPA.Results The expression of both TNF-α and IL-6 was significantly increased in the IPA tissues compared with those of NIPA(P＜0.05).Conclusion TNF-α and IL-6 may play a role in the occurrence and development of IPA.

invasive pituitary adenoma;tumor necrosis factor-α;interleukin-6

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.014

R739.41

A

1006-9771(2015)04-0432-04

2014-12-15

2015-03-05)

1.承德市中心医院，a.病理科；b.神经外科，河北承德市067000。作者简介：吴建龙(1983-)，男，汉族，河北三河市人，医师，主要研究方向：神经系统肿瘤。通讯作者：乔建勇，主任医师，教授、硕士研究生导师。E-mail:qiaojianyong@yeah.net。