番茄红素对大鼠脊髓损伤后白细胞介素-6表达及神经功能恢复的影响①

李佳励，唐丽娟，李晓，曹钰，杨拯

番茄红素对大鼠脊髓损伤后白细胞介素-6表达及神经功能恢复的影响①

李佳励1，唐丽娟2，李晓2，曹钰1，杨拯2

目的探讨番茄红素对大鼠脊髓损伤后白细胞介素-6(IL-6)表达的影响及对神经功能恢复的作用。方法健康成年Sprague-Dawley大鼠36只，采用Allen法(10 g×25 mm)在T9造成大鼠脊髓损伤模型，并随机分为对照组(A组)、甲泼尼龙(MP)治疗组(B组)和番茄红素治疗组(C组)，每组12只。造模成功30 min后，A组不给予治疗，B组腹腔注射MP 30 mg/kg，C组灌胃番茄红素20 mg/kg。于术后1 d、3 d、7 d分别对各组进行斜板试验。损伤段脊髓切片行免疫组织化学染色检测IL-6的表达。结果术后1 d和7 d，C组斜板试验评分均高于A组(P＜0.05)；术后1 d、3 d和7 d，B组斜板试验评分均高于A组(P＜0.05)。术后1 d、3 d和7 d，B组和C组IL-6表达均显著低于A组(P＜0.001)。结论番茄红素可以通过抑制IL-6的表达，减轻急性脊髓损伤后的炎症反应，并促进大鼠神经和运动功能恢复。

脊髓损伤；番茄红素；白细胞介素-6；炎症；大鼠

[本文著录格式]李佳励，唐丽娟，李晓，等.番茄红素对大鼠脊髓损伤后白细胞介素-6表达及神经功能恢复的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(4):402-405.

CITED AS:Li JL,Tang LJ,Li X,et al.Effect of lycopene on expression of interleukin-6 and recovery of neurological function in rats after spinal cord injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):402-405.

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重危害人类健康的疾病，其致残率和致死率都很高。据不完全统计，每年大约新增30万脊髓损伤患者。有研究表明，脊髓损伤后的免疫炎性反应可能是继发性脊髓损伤发生机制的核心，是继发性脊髓损伤的其他各种损伤机制的源头；并发现减轻脊髓损伤后早期炎症反应具有神经保护和促进功能恢复的作用[1]。

番茄红素(lycopene,LP)是一种开链式不饱和类胡萝卜素，具有多种优越的药理功能，应用前景广泛。它除具有高效猝灭单线氧态和清除自由基的能力外，

还可以通过多种途径发挥抗炎作用[2-3]。本研究探讨番茄红素对脊髓损伤后大鼠运动功能恢复及脊髓组织中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年Sprague-Dawley大鼠36只，雌雄各半，体质量(210±20)g，由四川省医学科学院/四川省人民医院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK(川) 2013-15。Allen法造模成功后随机分为对照组(A组)、甲泼尼龙琥珀酸钠治疗组(B组)和番茄红素治疗组(C组)，每组12只。每组再随机按1 d、3 d、7 d分成3个亚组，每个时间点4只。

1.2 主要试剂和仪器

6%番茄红素油树脂：新疆瑞德莱福生物科技有限公司，批号HY1007261。注射用甲泼尼龙琥珀酸钠：天津药业焦作有限公司，批号10031501。戊巴比妥钠：德国进口分装，北京化学试剂公司，批号100808。氯化钠注射液：安徽双鹤药业有限责任公司，批号110120 2E。注射用青霉素钠：瑞阳制药有限公司，批号10013101。IL-6抗体：北京博奥森生物技术有限公司，批号YEYE22W。兔抗大鼠二抗试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司，批号07E04AJ。自制数字式脊髓损伤动物模型制备仪[4-6]。

1.3 模型制备

大鼠1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉。俯卧位固定，背部去毛，常规消毒铺巾。以T9棘突为中心做背部正中切口，长约2 cm。明确T9位置后，小心去除T9椎骨上的肌肉，切除椎板，充分暴露脊髓。用自制数字式脊髓损伤动物模型制备仪制成脊髓损伤模型[4-6]，打击强度为10 g×25 mm，打击后即刻见鼠尾痉挛性摆动，双后肢和躯体发生不同程度抽搐，随后完全松弛，标志模型制备成功。逐层缝合切口。术后立即以9 ml/kg腹腔注射氯化钠注射液补液，腹腔注射青霉素预防感染。动物清醒后放回饲养笼中饲养。术后大鼠自由饮水、进食，保持适宜室温和湿度，定时清洁笼具，并保持大鼠身体干燥；每天挤压膀胱排尿3次，直至恢复自主排尿；术后每天腹腔注射青霉素8×104U，连续3 d。

1.4 治疗方法

A组造模成功后不给予任何药物治疗。B组造模成功后30 min按首次剂量30 mg/kg腹腔注射甲泼尼龙琥珀酸钠，此后按5.4 mg/(kg·h)，每6小时注射1次，共4次。C组造模成功后30 min用含番茄红素油树脂的色拉油2 ml(番茄红素20 mg/kg)灌胃，此后每天灌胃1次。

1.5 评定方法

1.5.1 斜板试验[5-7]

大鼠置于自制垫有橡胶垫的斜板上，使大鼠身体纵轴与斜板纵轴平行，头朝斜板抬高侧，斜板倾斜角度从0°开始缓慢上升。记录大鼠停留在斜板上维持至少5 s时的最大角度，每次测试3遍，取平均值。每次评分由熟悉评分标准但与实验无关的两人完成。

1.5.2 IL-6

斜板试验后，大鼠以1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉。开胸暴露心脏和升主动脉，将灌注管经左心室插入升主动脉，固定插管，剪开右心房。快速灌注冰生理盐水至肝脏和巩膜苍白，立即换4%多聚甲醛灌注150～200 ml，其中前1/3快速灌注，后2/3缓慢灌注，至鼠体变硬时停止。原路显露并仔细咬除T7-10棘突和椎板，切取损伤区域脊髓组织1 cm，石蜡包埋，横行切片，片厚5µm，行免疫组织化学检测IL-6。

1.5.3 图像采集与分析

每个免疫组化标本取1张切片，在同等亮度、像素、曝光、对比度等条件下使用Olympus拍照系统用10×40放大倍数，随机选择5个视野，进行拍照。用Image-Pro Plus 6.0图像处理系统计算每个视野的平均光密度值。

1.6 统计学分析

用SPSS 17.0统计软件处理。组间比较采用单因素ANOVA进行分析，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况

大鼠术后苏醒，静卧少动，气息较微，双后肢运动功能丧失，肌张力为0，无食欲，不进水，尿失禁或下腹部膨隆，发生尿潴留。术后前3 d，大鼠活动、进食较少，尿潴留比较严重，部分伴血尿和腹部胀气；此后饮食逐渐增加，活动逐渐增多。5～7 d后，所有大鼠能够基本恢复自主排尿，伤口未见感染，身体未出现压疮，36只大鼠均进入结果分析。

2.2 斜板试验

术后1 d、7 d，斜板试验评分C组均高于A组(P＜0.05)；术后1 d、3 d、7 d，斜板试验评分B组均高于A组(P＜0.05)。见表1。

2.3 IL-6

术后1 d、3 d和7 d，B组和C组IL-6都显著低于A组(P＜0.001)。见表2、图1。

表1 脊髓损伤大鼠斜板评分结果

表2 脊髓损伤大鼠IL-6的变化(AOD,×10-4)

图1 大鼠造模后IL-6表达(免疫组化染色,400×)

3 讨论

研究发现，免疫炎症反应在继发性脊髓损伤中扮演了重要角色[8]，而炎性细胞因子的表达贯穿炎症反应的始终。

炎性细胞因子主要由机体的免疫细胞分泌。正常情况下，细胞因子含量极低；但在各种因素刺激如感染、外伤、缺血刺激下，其表达可急剧增加，过度表达可导致或加重组织损伤[9]。因此，减轻脊髓损伤后

的早期炎症反应是治疗脊髓损伤的有效方法之一。

IL-6是一种来源广泛的多功能细胞因子，具有重要的生物学功能。已有研究表明，脊髓损伤后1 h，受伤的大鼠脊髓组织中IL-6的表达即明显升高，6 h达峰值，至损伤后24 h恢复正常水平[10-11]。

正常情况下，一定浓度IL-6是维持神经细胞正常生长和生存的基础，并影响神经细胞的分化、生长和生存。脊髓损伤后，产生过量的IL-6可促进星形胶质细胞活化，诱导硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate pro-teoglycans,CSPGs)表达上调，促进胶质瘢痕的形成，抑制轴突生长[8]。并且损伤局部继发性炎症反应导致IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α等过量细胞因子产生，是引起脊髓组织渐进性溃变坏死，形成脊髓空洞的主要原因。在脊髓损伤早期抑制IL-6表达，可以减轻免疫炎症反应，促进损伤后神经功能的再生与修复，加快脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。

番茄红素作为一种纯天然营养素，具有多种优越的生理功能。我们前期实验已经证实，番茄红素通过清除自由基，减轻大鼠脊髓损伤后脂质过氧化反应，促进其运动功能的恢复[3]。大量研究显示，番茄红素还可以通过多种途径发挥其抗免疫炎症反应的作用。研究发现，番茄红素可通过抑制脂多糖诱导的一氧化氮和IL-6产生，减少免疫炎症反应[12]。Kang等发现番茄红素能抑制由蛙皮素激活的胰腺腺泡细胞中IL-6的表达，对于治疗胰腺炎有良好的效果[10]。

本研究显示，可通过在脊髓损伤后抑制IL-6的表达，减轻炎症反应脊髓血管和神经细胞等的继发损伤，发挥神经组织保护作用，从而有效促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。番茄红素作为新型功能性天然营养素，具有抗氧化和抗炎等多种生物学功能，用于治疗脊髓损伤安全、副作用小，有望成为临床治疗脊髓损伤的备选药物之一，有必要进一步深入探讨其对脊髓损伤的保护作用及其机制。

[1]Rowland JW,Hawryluk GW,Kwon B,et al.Current status of acute spinal cord injury pathophysiology and emerging therapies:promise on the horizon[J].Neurosurg Focus,2008,25 (5):E2.

[2]Simone RE,Russo M,Catalano A,et al.Lycopene inhibits NF-κB-mediated IL-8 expression and changes redox and PPARγsignallingincigarettesmoke-stimulatedmacrophages[J].PloS One,2011,6(5):e19652.

[3]Palozza P,Simone R,Catalano A,et al.Lycopene prevention of oxysterol-induced proinflammatory cytokine cascade in human macrophages:inhibition of NF-κB nuclear binding and increase in PPARγ expression[J].J Nutr Biochem,2011,22: 259-268.

[4]陈建敏,谢少华,杨拯,等.银杏叶提取物抗氧化作用对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响[J].中国康复理论与实践, 2013,19(12):1124-1127.

[5]李晓,罗晨禹,杨拯,等.番茄红素抗氧化应激效应对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响[J].中国康复理论与实践,2013, 19(2):132-135.

[6]谢少华,杨拯,龚都,等.原花青素对脊髓损伤大鼠运动功能的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(9):831-833.

[7]Rivlin AS,Tator CH.Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in rat[J].J Neurosurg,1977,47(4):577-581.

[8]Leal-Filho MB.Spinal cord injury:From inflammation to glial scar[J].Surg Neurol Int,2011,2:112.

[9]Hanada T,Yoshimura A.Regulation of cytokine signaling and inflammation[J].Cytokine Growth Factor Rev,2002,13(4-5): 413-421.

[10]Kang M,Park KS,Seo JY,et al.Lycopene inhibits IL-6 expression in cerulein-stimulated pancreatic acinar cells[J]. Genes Nutr,2011,6(2):117-123.

[11]de Rivero Vaccari JP,Lotocki G,Marcillo AE,et al.A molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury[J].J Neurosci,2008,28(13):3404-3414.

[12]Gouranton E,Thabuis C,Riollet C,et al.Lycopene inhibits proinflammatory cytokine and chemokine expression in adipose tissue[J].J Nutr Biochem,2011,22(7):642-648.

Effect of Lycopene on Expression of Interleukin-6 and Recovery of Neurological Function in Rats after Spinal Cord Injury

LI Jia-li1,TANG Li-juan2,LI Xiao1,CAO Yu1,YANG Zheng2
1.Department of Emergency Treatment,the West China Hospital of Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610041,China;2.School of Basic Medical Science,Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

Objective To explore the effects of lycopene on interleukin-6(IL-6)expression and motor function after spinal cord injury in rats.Methods 36 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group(A),methylprednisolone sodium succinate (MP)treatment group(B)and lycopene treatment group(C)with 12 rats in each group,and spinal cord injury model at T9was established with modified Allen's technique(10 g×25 mm).30 minutes after modeling,group A received no treatment,group B was injected MP 30 mg/ kg,group C was given lycopene 20 mg/kg.They were tested with inclined plate test 1 day,3 days and 7 days after injury.The expression of IL-6 was examined with immunohistochemistry,then.Results The inclined plate test scores were higher in the group C than in the group A 1 day and 7 days after injury(P＜0.05),and in the group B than in the group A 1 day,3 days and 7 days after injury(P＜0.05).The expression of IL-6 was significantly lower in the groups B and C than in the group A 1 day,3 days,7 days after injury(P＜0.001).Conclusion Lycopene can inhibit the expression of IL-6 in acute spinal cord injury to reduce the inflammation and facilitate the recovery of nerve and motor function.

spinal cord injury;lycopene;interleukin-6;inflammation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.008

R651.2

A

1006-9771(2015)04-0402-04

2014-03-14

2014-05-22)

1.四川大学华西医院急诊科，四川成都市610041；2.成都医学院基础医学实验教学中心,四川成都市610500。作者简介：李佳励(1983-)，女，汉族，四川简阳市人，硕士研究生，医师，主要研究方向：急救医学及脊髓损伤的治疗。通讯作者：杨拯、曹钰。E-mail:yzixjj@ 163.com(杨拯)、yuyuer@126.com(曹钰)。