脊髓切开术对大鼠脊髓损伤区自噬的影响①

杨德刚，李建军，杨明亮，杜良杰，胡安明，顾蕊，陈亮，褚宏宇，张宪娣，吴海丰

脊髓切开术对大鼠脊髓损伤区自噬的影响①

杨德刚1a,2，李建军1,2，杨明亮1a,2，杜良杰1a,2，胡安明1a,2，顾蕊1b,2，陈亮1a,2，褚宏宇1a,2，张宪娣1c,2，吴海丰1c,2

目的观察脊髓切开术干预后大鼠脊髓损伤区自噬活性的变化。方法54只成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=18)、挫伤组(n=18)和手术组(n=18)。用NYU打击器制备T10脊髓挫伤模型。手术组在造模后24 h行脊髓切开术。在伤后第1、7、14天，采用开放场地试验评估大鼠运动功能；RT-PCR检测Beclin-1和Bcl-2的mRNA表达；伤后3 d开始电镜观察自噬体。结果损伤后7 d、14 d，手术组大鼠BBB评分高于挫伤组(P＜0.05)，Beclin-1 mRNA水平低于挫伤组(P＜0.05)；伤后3 d、7 d，Bcl-2 mRNA水平高于挫伤组(P＜0.05)。伤后7 d、14 d，大鼠脊髓损伤区的Beclin-1 mRNA水平与行为学评分负相关(P＜0.01)。脊髓挫伤后自噬体形成增多，手术组自噬体形成减少。结论脊髓切开术能改善创伤性脊髓损伤大鼠的运动功能，可能与抑制自噬、上调Bcl-2 mRNA表达有关。

脊髓损伤；自噬；Beclin-1；Bcl-2；脊髓切开术

[本文著录格式]杨德刚，李建军，杨明亮，等.脊髓切开术对大鼠脊髓损伤区自噬的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21 (4):382-386.

CITED AS:Yang DG,Li JJ,Yang ML,et al.Effects of myelotomy on autophagy in injured spinal cord in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):382-386.

创伤性脊髓损伤的病理生理机制包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤即刻发生，继发性损伤从伤后数分钟开始至数周，可使原发病灶明显扩大。阻止继发性损伤进展是非常关键的治疗策略。

出血和水肿是继发性损伤机制中两个重要的始动因素。脊髓切开术是一种清除损伤部位出血和坏死组

织的手术方法，因而可能是预防继发性损伤非常有希望的方法之一。目前有许多基础和临床研究证明脊髓切开术的疗效[1-5]，但其分子机制仍然不清楚。

中枢神经系统创伤后，在损伤中心即刻出现细胞坏死，随之而来的细胞凋亡和自噬迅速波及病灶周围半暗带区，使原始损伤病灶变大[6-8]。自噬的异常激活能引起自噬性细胞死亡，是许多神经系统疾病神经组织损伤的机制之一[9-11]。最近研究发现，自噬在脊髓损伤后神经组织损伤中扮演重要角色[12-13]。本研究观察脊髓损伤后自噬活性的变化以及脊髓切开术对其干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

54只雌性成年Sprague-Dawley大鼠，体重(250± 10)g，清洁级，军事医学科学院实验动物中心提供，约11周龄。每只单笼饲养，室温23～28℃。

将大鼠编号，应用随机数字表法随机分为假手术组、挫伤组和手术组，每组18只。假手术组仅行椎板切除术；挫伤组接受椎板切除术和脊髓挫伤；手术组接受椎板切除术、脊髓挫伤和脊髓切开术，脊髓切开术的实施时间在脊髓挫伤后24 h。

1.1.2 主要仪器和试剂

脊髓损伤打击器：New York University。手术显微镜：Carl Zeiss公司。Hitachi-H600透射电镜：日立公司。TL988-Ⅱ型荧光定量PCR仪：西安天隆公司。β-actin基因及Bcl-2、Beclin-1引物：北京雷根生物技术有限公司设计并合成。见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 模型制作

大鼠水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧位，碘伏消毒、铺无菌巾。以T10为中心纵行切口，长约1.5 cm，显微镜下沿棘突向两侧逐层分离，暴露T9-11棘突、椎板。游离T10椎板上下缘、双侧关节突，去除T10椎板，暴露硬脊膜。使用NYU打击器10 g× 2.5 cm打击。打击后逐层缝合。将大鼠放入保温箱内单笼饲养。术后肌肉注射青霉素2×104U，每天2次，连续5 d。每8小时人工排尿1次，直至反射性排尿建立。

1.2.2 脊髓切开术

造模成功后24 h，大鼠水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒铺巾，拆除缝线。显微镜下见硬脊膜完整，膨隆，颜色淤青，缺乏搏动性。参考既往研究[14]，先以1 ml一次性注射器针头将硬脊膜刺1个小口，稍偏于背侧中线，避开迂曲增粗的脊髓后正中静脉；显微剪刀纵行剪开硬脊膜，长约3.5 mm，可见有脊髓组织膨出；钝性探针(由KRAYE-NBUHL神经钩改造，尖直径约0.2 mm)分离蛛网膜，沿后外侧沟至中央管方向钝性分离脊髓，深约1～1.5 mm，进入脊髓坏死腔，可见暗红色液体伴有白色物质涌出。以37℃生理盐水轻柔冲洗术腔2遍，无菌棉球蘸干水分，将硬脊膜复位，表面贴附2×2 mm明胶海绵，逐层缝合肌肉筋膜和皮肤，再次消毒。

1.2.3 RT-PCR

伤后3 d、7 d、14 d，每组随机选取5只大鼠，麻醉，快速暴露损伤区，以受伤处为中心取15 mm长脊髓段，液氮保存。按Trizol说明书行RNA提取。反应体系：总RNA 2 μg、Oligo d(T)1 μl、10×RT Buffer 4 μl、dNTP Mixture 2 μl、RNase Inhibitor 1 μl、Cth逆转录酶1 μl，最后加RNase Free H2O至20 μl。反应条件：95℃2 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，72℃处读荧光值，共45个循环。

采用2-△△Ct值法计算相对比值。

1.2.4 电镜观察

伤后3 d，各组分别取3只大鼠，2.5%多聚甲醛和2%戊二醛混合液灌注，完整取出含损伤区的脊髓组织，切取含损伤点至损伤中心头端3 mm间的脊髓段，在脊髓背外侧区域切取1×1×3 mm的组织块，同一固定液中4℃固定2 h。取出标本，0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液冲洗3次，1%四氧化锇4℃固定2 h，PBS冲洗，梯度酒精和氧化丙烯脱水，环氧树脂包埋。切取70 nm厚超薄切片，乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察。

1.2.5 行为学观察

造模后1 d、7 d、14 d采用BBB评分法评估大鼠后肢行为学功能。由经过培训的两名观察者独立进行，将单只大鼠置于直径90 cm带围挡的圆形平板

内，持续观察其行为活动5 min，同时摄像并记录。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BBB评分

假手术组大鼠伤后7 d、14 d时BBB评分均为21分，不参与统计检验。挫伤组与手术组大鼠在脊髓损伤后1 d时双下肢无任何自发活动，BBB评分为0分，不进行统计检验。伤后7 d、14 d，手术组BBB评分较挫伤组提高(P＜0.05)。见表2。

2.2 Beclin-1、Bcl-2 mRNA的表达

伤后7 d、14 d时，手术组Beclin-1 mRNA水平低于挫伤组(P＜0.05)。见表3。伤后3 d、7 d时，手术组Bcl-2 mRNA水平高于挫伤组(P＜0.05)。见表4。

挫伤组与手术组大鼠伤后7 d(r=-0.838,P= 0.002)、14 d(r=-0.838,P=0.002)脊髓损伤区的Beclin-1 mRNA水平均与BBB评分负相关。

2.3 电镜观察

挫伤组和手术组在临近损伤中心可见双层膜结构自噬体，直径300～900 nm，空泡内密度不均匀，可见未降解的吞噬物质；粗面内质网肿胀，结构松散。与挫伤组比较，手术组的自噬体数量减少。见图1。

表23 组BBB评分情况

表3 挫伤组和手术组Beclin-1 mRNA表达(2-△△Ct)

表4 挫伤组和手术组Bcl-2 mRNA表达(2-△△Ct)

图1 各组大鼠脊髓自噬体观察

3 讨论

脊髓切开术应用于脊髓损伤治疗的基础研究和临床研究已经有一个多世纪[4]。许多研究显示脊髓切开术治疗脊髓损伤的有效性[2-5,15]。本研究中也观察到，脊髓切开术能改善大鼠创伤性脊髓损伤早期的运动障碍。然而有关脊髓切开术治疗脊髓损伤的机制研究甚少。既往许多研究观察了病理组织学变化，如病灶面积、空洞体积[16]，但缺乏分子生物学方面的研究。

自噬是近年来分子生物学的研究热点。自噬是指溶酶体降解并利用细胞内物质成分(如长寿命蛋白、衰老或功能异常的细胞器、脂滴)的过程，在细胞能量需求增加时提供代谢底物，发挥内稳态功能[17-18]。但自噬的过度活化会引起细胞损伤，导致细胞死亡，被称为自噬相关性死亡[19]。

近来发现，脊髓损伤后脊髓组织自噬表达明显增多，自噬可能参与脊髓损伤后的继发性损伤过程[13,20]。Beclin-1(自噬相关基因6)是参与自噬启动信号调控的关键蛋白[21]，也是Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶复合体的成分。Beclin-1-Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶复合体参与调控自噬，该复合体可刺激生成磷脂酰肌醇-3磷酸盐(PI3P)，后者能促进自噬体膜成核形，促进自噬体形成。因此，Beclin-1对于自噬体的形成是必要的[22]。

Kanno在小鼠脊髓半切伤后行Beclin-1和TUNEL双标记，结果Beclin-1和TUNEL均为阳性的细胞胞核为圆形，不像凋亡细胞核那样皱缩或成碎片，因此推测脊髓损伤后发生了自噬性死亡[23]，而且Beclin-1的表达时程与脊髓损伤后凋亡时程类似[6]。

本研究应用RT-PCR检测到脊髓损伤后Beclin-1 mRNA水平增高，在伤后7 d达高峰，提示大鼠脊髓挫伤后存在自噬活性增强。

电镜是应用最广泛的自噬检测方法之一。自噬体的形成被认为是自噬检测的“金标准”[22,24]。成熟的自噬体是双层膜结构，与溶酶体融合后转变为单层膜结构。本研究发现，假手术组脊髓组织中很少见到自噬体，组织超微结构基本正常；手术组脊髓组织中能够观察到自噬体形成，数量略少于挫伤组。自噬体数目增多也提示可能存在自噬活性增强。结合Beclin-1 mRNA的表达，提示大鼠脊髓挫伤后自噬活性增强，自噬活性的高峰可能在脊髓挫伤后7 d，持续至少到伤后14 d。

本研究显示，脊髓切开术治疗后，自噬标记性分子Beclin-1的表达降低，提示脊髓切开术抑制了自噬活性。

自噬过程的信号调控机制非常复杂，目前尚未被完全了解。Bcl-2家族不仅参与凋亡调控，也参与自噬相关性死亡调控[25-26]。Bcl-2蛋白家族在调节自噬时扮演双重角色。抗凋亡蛋白如Bcl-2，能够抑制自噬；而促凋亡BH3蛋白能够诱导自噬[25-26]。Bcl-2绑定到Beclin-1，能打破Beclin-1和hVps34的结合，降低Beclin-1关联的hVps34 PtdIns3K活性，从而抑制自噬。脑损伤研究发现，自噬抑制剂3-MA能上调Bcl-2蛋白水平，下调Beclin-1蛋白水平[27]。本研究显示，手术组Bcl-2 mRNA水平高于挫伤组，Beclin-1 mRNA水平下降，说明脊髓切开术对自噬的抑制可能与Bcl-2的表达上调有关。

脊髓切开术的作用机制非常复杂，可能涉及许多方面，如微循环障碍、髓内压力、氧化应激等。本研究从自噬激活方面初步阐释脊髓切开术治疗大鼠脊髓损伤的分子生物学机制，为深入研究其保护机制提供了一些理论基础，也为脊髓切开术在临床的应用提供一些实验依据。

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Effects of Myelotomy onAutophagy in Injured Spinal Cord in Rats

YANG De-gang,LI Jian-jun,YANG Ming-liang,DU Liang-jie,HU An-ming,GU Rui,CHEN Liang,CHU Hong-yu,ZHANG Xian-di,WU Hai-feng
1.Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;2.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China

Objective To observe the effects of myelotomy on autophagy activation after traumatic spinal cord injury(SCI)in rats. Methods 54 adult female Sprague-Dawley rats were randomly assigned to sham-operated group(SG,n=18),contusion group(CG,n=18)or myelotomy group(MTG,n=18).The T10SCI model in rats was induced with a New York University(NYU)impactor and myelotomy was performed 24 hours after SCI.They were evaluated with the BBB score 1,7,14 days after injury.The expression of mRNA of Beclin-1 and Bcl-2 were detected with real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR).The formation of autophagosome was investigated under electronic microscope(EM)3 days after injury.Results BBB score was more in the MTG than in the CG 7 and 14 days after injury(P＜0.05),while the expression of Beclin-1 mRNA was less(P＜0.05).The expression of Bcl-2 mRNA was more in the MTG than in the CG 3 and 7 days after injury(P＜0.05).The expression of Beclin-1 mRNA was negatively correlated with BBB scores(P＜0.05).The formation of autophagosome was less in the MTG than in the CG.Conclusion Myelotomy can improve the recovery of motor function in rats after acute traumatic SCI,which may associate with neuroprotection mediated by inhibition of autophagy through the Bcl-2 signaling pathway.

spinal cord injury;autophagy;Beclin-1;Bcl-2;myelotomy

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.003

R651.2

A

1006-9771(2015)04-0382-05

2014-07-19

2014-09-05)

1.国家自然科学基金项目(No.81272164)；2.中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(No.2011CZ-2)。

1.中国康复研究中心北京博爱医院，a.脊柱脊髓神经功能重建科，b.骨科，c.科教处，北京市100068；2.首都医科大学康复医学院，北京市100068。作者简介：杨德刚(1978-)，男，汉族，山东滨州市人，博士，主治医师，主要研究方向：脊柱脊髓损伤的治疗与康复。通讯作者：李建军，男，博士生导师，主任医师，教授。E-mail:crrc100@gmail.com。