莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受体Tie-2的影响①

刘婷婷，孙芳玲，程华，艾厚喜，张丽，王文

莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受体Tie-2的影响①

刘婷婷，孙芳玲，程华，艾厚喜，张丽，王文

目的观察莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管生成素1(Ang-1)及其受体Tie-2的影响。方法20只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组，每组4只。线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型，术后予莫诺苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃。术后7 d采用Western blotting法分析皮层Ang-1及其受体Tie-2的表达。结果模型组患侧皮层Ang-1、Tie-2的表达均比假手术组明显增加(P＜0.01)。莫诺苷大剂量组Ang-1、Tie-2的表达较模型组明显提高(P＜0.01)，莫诺苷中、大剂量组Tie-2的表达较模型组显著提高(P＜0.001)。结论莫诺苷能上调局灶性脑缺血大鼠缺血再灌注皮层Ang-1及受体Tie-2的表达，促进血管再生。

莫诺苷；脑缺血再灌注；血管生成素1；Tie-2；血管再生；大鼠

[本文著录格式]刘婷婷，孙芳玲，程华，等.莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管生成素1及其受体Tie-2的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(1):9-11.

CITED AS:Liu TT,Sun FL,Cheng H,et al.Effects of morroniside on expression of Angiopoietin-1 and Tie-2 in rats after focal cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):9-11.

缺血性脑卒中是脑卒中最常见类型，严重威胁人类健康[1]。动物实验证实，缺血性脑卒中后，神经血管单元的微环境改变，诱导血管发生。形态学分析表明，缺血后2～7 d梗死灶周边可见毛细血管重建，缺血半暗带扩大，且有壁薄的血管形成，并在缺血后2～28 d逐渐发展成小血管，通过发芽和套叠的方式延伸到缺血中心区[2]。新生血管为新生神经元提供重要的神经营养来源[3]，神经祖细胞也会沿着新生血管迁移到梗死周边区[4-5]。Navarro-Sobrino等证明，脑缺血后血管新生是形成大脑新生微血管的重要过程，可以改善缺血周边区域的组织低灌注[6]。缺血性脑损伤患者脑内新生血管密度与患者的生存时间存在一定关系，新生血管密度增加多的患者，预后较好[7]。疾病刺激机体自身的血管新生反应短暂而微弱，不足以很好改善脑缺血后的神经功能恢复。通过外源性药物或其他手段刺激血管新生，可能能更好地促进缺血性脑损伤后的神经康复。

血管生成素1(Angiopoietin-1,Ang-1)是血管生成素家族的重要成员，Tie-2是其内皮特异性酪氨酸激酶受体。研究表明，Ang-1/Tie-2系统在血管生成过程中

起关键作用[8-9]。Beck等证明，在脑缺血后恢复期，Ang-1/Tie-2水平的上调可以促进脑缺血边缘带新生血管形成[10]。另外，缺血后Ang-1能促进神经发生和血管发生过程的紧密联系[11]。

莫诺苷是本课题组从中药山茱萸中筛选出的有效成分，前期研究显示，莫诺苷可以明显改善脑缺血再灌注引起的神经功能缺损，减少大脑梗死体积，使神经元死亡减少，起到神经保护作用[12-14]。我们发现，莫诺苷能够促进大鼠脑缺血后梗死灶周边皮层区域血管密度增加。因此，本研究在大鼠脑缺血再灌注模型上进一步对莫诺苷对血管生成相关因子Ang-1及Tie-2表达的影响进行研究，为莫诺苷对大鼠缺血性脑损伤后血管新生的作用及机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

莫诺苷由首都医科大学宣武医院药物研究室从山茱萸中提取制备，HPLC分析纯度大于98.5%。Ang-1兔多抗(BA0636)：武汉博士德生物工程有限公司。Tie-2兔多抗(sc-324)：美国SANTA CRUZ公司。β-actin鼠单抗(TA-09)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(ZB-2301)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗(ZB-2010)：北京市中杉金桥生物技术有限公司。RIPA裂解液(P0013B)：碧云天生物技术研究所。BCA法蛋白定量试剂盒(P1511)：北京普利莱基因技术有限公司。ECL Western Blotting Kit(32109)：美国THERMO-PIERCE公司。

1.2 实验动物分组及给药

20只SPF级Sprague-Dawley雄性成年大鼠，体质量260～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：SCXK(京)2007-0001。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型后，随机分为假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组，每组4只。术后莫诺苷小、中、大剂量组予莫诺苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃给药，连续7 d，假手术组和模型组予等量生理盐水。

1.3 模型制备

采用改良Longa线栓法[15]。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于鼠板上，颈部正中切口，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉近心端，动脉夹与颈总动脉近心端之间结扎一道缝合线，不扎紧。在颈总动脉接近颈外动脉和颈内动脉分叉处用眼科剪做一斜行细切口，将直径为0.26 mm的尼龙线插入，稍扎紧缝合线，推动尼龙线进入颈内动脉，至距颈外动脉和颈内动脉分叉处约2 cm时，会有阻挡感，说明栓线已越过大脑中动脉，到达大脑前动脉的起始部。记录阻塞开始时间，结扎颈总动脉上端。缝合肌肉、皮肤。阻塞后30 min(若此时大鼠已苏醒则需要再次麻醉)，拔出尼龙线。

假手术组除不插入尼龙线外，其他操作相同。

1.4 模型成功及评价标准

参照Longa及Bederon评分方法[15-16]对实验动物进行神经行为学评分。将0分、1分及4分大鼠剔除，并补充各组设计所需大鼠数量。

1.5 Western blotting

术后7 d，大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉。迅速剥离大脑并将脑膜剥去，取出患侧皮层包入锡箔纸中，放入液氮中冻存片刻，-80℃保存。取患侧皮层于5 ml EP管中称重，加入预冷的裂解液7 μl/mg组织、PMSF 1 μl/100μl RIPA，冰上充分超声粉碎。4℃静止30 min，4℃12000 r/min离心30 min。取上清测定蛋白浓度，总蛋白与5×上样缓冲液1∶4稀释，95℃变性10 min。

Ang-1采用10%SDS-PAGE分离胶，Tie-2采用8%SDS-PAGE分离胶；浓缩胶用5%SDS-PAGE。电泳：浓缩胶电压60 V，40 min，分离胶电压90 V，90 min，分离蛋白。电泳后用0.45 μm NC膜进行转膜；条带在5%脱脂奶粉中封闭2 h；分别用兔多克隆Ang-1抗体(1∶200)、兔多克隆Tie-2抗体(1∶200)和小鼠单克隆β-actin抗体(1∶1000)，4℃冰箱孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min。加相应辣根过氧化物酶结合二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min；ECL显色1 min，滤去显色液，凝胶成像仪拍片。用Quanity One软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 Ang-1

模型组Ang-1水平比假手术组明显升高(P＜0.01)；与模型组大鼠相比，莫诺苷大剂量组Ang-1水

平明显增加(P＜0.01)。莫诺苷小、中剂量组表达水平与模型组相比有升高趋势，但无显著性差异。见表1。

2.2 Tie-2

模型组Tie-2水平较假手术组显著升高(P＜0.001)；与模型组大鼠相比，莫诺苷中、大剂量组皮层Tie-2蛋白表达显著增加(P＜0.001)。莫诺苷小剂量组表达水平与模型组相比有升高趋势，但无显著性差异。见表1。

表1 各组患侧皮层Ang-1、Tie-2灰度比较(/β-actin)

3 讨论

在血管新生过程中，Ang-1/Tie-2对于新生血管的形成、重塑、稳定、成熟都起举足轻重的作用[17]。Ang-1/Tie-2特异性表达于内皮细胞和早期造血细胞[18]。受体Tie-2在大脑发育中的脉管系统内表达量较高，但成年后表达量维持在较低水平。Ang-1与其受体Tie-2结合后可以促进新生内皮细胞存活，调节血管萌芽和分枝形成，募集内皮周围支持细胞，最终促进血管重塑和成熟[19-20]。

脑缺血后，大脑皮层内Ang-1与Tie-2蛋白及mRNA表达水平均增加，这对于缺血后梗死周边区域残存血管结构的维持、大规模血管重塑和血管新生起到关键作用[21-22]。Beck等发现，缺血性脑损伤后，Ang-1/Tie-2水平的上调在时空和数量上调节梗死中心及半暗带新生血管和侧支循环的形成，促进脑血流恢复，改善缺血周边能量代谢，促进功能恢复[10]。

本研究显示，大鼠脑缺血再灌注7 d后，大脑患侧皮层Ang-1和Tie-2蛋白表达升高，与上述结果一致，提示缺血性脑损伤刺激促血管新生因子的生成，使神经血管单元的微环境发生改变。给予莫诺苷治疗后，Ang-1和Tie-2蛋白表达水平进一步增加。结合前期研究结果，我们推断莫诺苷能够通过调节局灶性脑缺血后Ang-1及其受体Tie-2的表达，在一定程度上改善脑内神经血管单元微环境，实现促血管新生的作用，在缺血性脑损伤的治疗中有着良好前景。

[1]Lo EH,Dalkara T,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nature Rev Neurosci,2003,4(5):399-415.

[2]Pettersson A,Nagy JA,Brown LF,et al.Heterogeneity of the angiogenic response induced in different normal adult tissues by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor[J].Lab Invest,2000, 80(1):99-115.

[3]Goldman SA,Chen Z.Perivascular instruction of cell genesis and fate in the adult brain[J].Nat Neurosci,2011,14(11):1382-1389.

[4]Tsai PT,Ohab JJ,Kertesz N,et al.A critical role of erythropoietin receptor in neurogenesis and post-stroke recovery[J].J Neurosci,2006,26 (4):1269-1274.

[5]Wang L,Chopp M,Gregg SR,et al.Neural progenitor cells treated with EPO induce angiogenesis through the production of VEGF[J].J Cereb Blood Flow Metab,2008,28(7):1361-1368.

[6]Navarro-Sobrino M,Rosell A,Hernandez-Guillamon M,et al.A large screening of angiogenesis biomarkers and their association with neurological outcome after ischemic stroke[J].Atherosclerosis,2011,216 (1):205-211.

[7]Ohab JJ,Fleming S,Blesch A,et al.A Neurovascular niche for neurogenesis after stroke[J].J Neurosci,2006,26(50):13007-13016.

[8]Zhang ZG,Zhang L,Tsang W,et al.Correlation of VEGF and angiopoietin expression with disruption of blood-brain barrier and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22 (4):379-392.

[9]Lin TN,Wang CK,Cheung WM,et al.Induction of angiopoietin and Tie receptor mRNA expression after cerebral ischemia-reperfusion[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(2):387-395.

[10]Beck H,Acker T,Wiessner C,et al.Expression of angiopoietin-1,angiopoietin-2，and tie receptors after middle cerebral artery occlusion in the rat[J].Am J Pathol,2000,157(5):1473-1483.

[11]Krupinski J,Kaluza J,Kumar P,et al.Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke[J].Stroke,1994,25(9):1794-1798.

[12]Wang W,Xu J,Li L,et al.Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res Bull,2010,83(5):196-201.

[13]Wang W,Sun F,An Y,et al.Morroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity[J]. Eur J Pharmacol,2009,613(1-3):19-23.

[14]Wang W,Huang W,Li L,et al.Morroniside prevents peroxide-induced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cells[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28(2):293-305.

[15]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1): 84-91.

[16]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[17]Gale NW,Yancopoulos GD.Growth factors acting via endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases:VEGFs,angiopoietins,and ephrins in vascular development[J].Genes Dev,1999,13(9):1055-1066.

[18]Suri C,Jones PF,Patan S,et al.Requisite role of angiopoietin-1,a ligand for the TIE2 receptor,during embryonic angiogenesis[J].Cell, 1996,87(7):1171-1180.

[19]Beck H,Plate KH.Angiogenesis after cerebral ischemia[J].Acta Neuropathol,2009,117(5):481-496.

[20]Qin D,Trenkwalder T,Lee S,et al.Early vessel destabilization mediated by angiopoietin-2 and subsequent vessel maturation via angiopoietin-1 induce functional neovasculature after ischemia[J].PLoS One, 2013,8(4):e61831.

[21]Ma XL,Liu KD,Li FC,et al.Human mesenchymal stem cells increases expression of a-tubulin and angiopoietin 1 and 2 in focal cerebral ischemia and reperfusion[J].Curr Neurovasc Res,2013,10(2): 103-111.

[22]Zheng Q,Zhu D,Bai Y,et al.Exercise improves recovery after ischemic brain injury by inducing the expression of angiopoietin-1 and Tie-2 in rats[J].Tohoku J Exp Med,2011,224(3):221-228.

Effects of Morroniside on Expression of Angiopoietin-1 and Tie-2 in Rats after Focal Cerebral Ischemia-reperfusion

LIU Ting-ting, SUN Fang-ling,CHENG Hua,AI Hou-xi,ZHANG Li,WANG Wen.Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing Geriatric Medical Research Center,Beijing 100053,China

Objective To explore the effects of morroniside on the expression of Angiopoietin-1(Ang-1)and Tie-2 in a rat after focal cerebral ischemia-reperfusion.Methods 20 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=4),ischemia group(n=4), and morroniside groups(low,medium and high dosage groups,n=4).The middle cerebral artery were occluded for 30 min,and re-perfused. Morroniside was administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg,90 mg/kg and 270 mg/kg after operation.The expression of Ang-1 and Tie-2 in the ischemic ipsilateral cortex were detected with Western blotting analysis 7 days after operation.Results The expression of Ang-1 and Tie-2 increased in the ischemia group compared with the sham group(P＜0.01),and both of them further increased in the morroniside groups of high dosage compared with the ischemia group(P＜0.01),and the expression of Tie-2 also increased in the morroniside groups of medium dosage(P＜0.001).Conclusion Morroniside could increase the expression of Ang-1 and Tie-2 in the ischemic ipsilateral cortex after ischemia-reperfusion in rats,suggesting promoting the angiogenesis after ischemia.

morroniside;ischemia-reperfusion;Angiopoietin-1;Tie-2;angiogenesis;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.003

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0009-03

2014-11-24

2014-12-11)

1.“重大新药创制”科技重大专项(No.2012ZX09102201-016)；2.国家自然科学基金项目(No.81173575；No.81373994)；3.首都医科大学宣武医院院级课题。

首都医科大学宣武医院动物实验室，北京市老年病医疗研究中心，北京重大疾病研究院，北京市100053。作者简介：刘婷婷(1988-)，女，汉族，河北沧州市人，博士研究生，主要研究方向：神经药理。通讯作者：王文，男，博士，教授，博士生导师。E-mail:lzwwang@ 163.com。