采前水杨酸处理对杏果实抗病性及苯丙烷代谢的诱导

赵亚婷，朱 璇*，马 玄，郭杨美娟

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

采前水杨酸处理对杏果实抗病性及苯丙烷代谢的诱导

赵亚婷，朱 璇*，马 玄，郭杨美娟

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

以新疆赛买提杏为试材，在果实坐果期、膨大期、转色期及采收前48 h的4 个时期，采用1.0 mmol/L水杨酸对杏果实进行喷施处理，以喷清水处理作为对照。采收后的杏果实置于4 ℃、90%～95%相对湿度条件下贮藏，定期统计杏果实接种链格孢（Alternaria alternata）的病斑直径和接种发病率，测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羟化酶（C4H）、4-香豆酰-辅酶A连接酶（4-CL）的活性及木质素、总酚和类黄酮的含量，研究采前水杨酸处理对杏果实抗病性和苯丙烷代谢关键酶活性及代谢产物积累的影响。结果显示：采前水杨酸处理能有效降低杏果实损伤接种的病斑直径和接种发病率，显著提高杏果实PAL、C4H、4-CL的活性和木质素、总酚、类黄酮的含量。

杏；水杨酸；苯丙烷代谢；采后病害；诱导抗性

杏是营养丰富的时令水果，其香气浓郁，风味极佳含有多种人体所需的营养物质，作为鲜食果品深受人们的喜爱。但由于杏采收时正值高温夏季，加之果实对机械损伤敏感，后熟过程迅速，易受病原物的侵染而发生腐烂，烂损极为严重，其中由链格孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病，是杏果实采后的主要病害[1]。目前采用化学杀菌剂在一定程度上可以减缓病害的发生，但使用化学杀菌剂存在抗性提高和杀菌剂残留所引起的环境污染问题等，使其应用受到限制。因此，需要寻找一种安全有效的病害控制技术。近年来，抗病诱导剂在果蔬贮藏中的应用逐渐被重视，其作用原理是通过激发果蔬自身防御系统，增强果蔬对采后病害的抵抗能力，具有多抗性、持久性、稳定性、迟滞性和安全性等优点[2]，这为果蔬采后病害的防治以及贮藏品质的保持开辟了一条安全环保的途径。

水杨酸（salicylic acid，SA）是普遍存在于高等植植物体内的酚类激素，参与植物抗逆性反应信息传递，进而激发植物细胞内的各种防卫反应和产生系统获得性抗性，是一种有效的植物抗性诱导制剂[3]。有关SA诱导果蔬的抗病性已有较深入和广泛的研究，如施用外源SA可诱导柑橘[4]、枣[5]、猕猴桃[6]、番茄[7]等果实对采后病害的抗性。苯丙烷类代谢是酚类物质代谢的重要途径，其代谢产物木质素、酚类物质、异黄酮类、植保素等与植物抗病性密切相关。研究[8]证实，SA能够通过诱导厚皮甜瓜果实的苯丙烷代谢来增强果实的抗病性。但水杨酸诱导果蔬抗病性的效果因果蔬种类、诱导时间及诱导处理方法的不同而不同。目前关于苯丙烷类代谢途径及其代谢产物对果蔬抵抗病原菌作用的研究多数集中在甜瓜[9]、甘薯[10]等果蔬上，而针对杏果实的研究较少。因此，本实验旨在研究采前SA处理对采后果实损伤接种A. alternata病斑直径以及低温贮藏期间果实接种发病率的抑制效果，从苯丙烷类代谢的角度探讨SA处理诱导果实提高抗病性的机理，为开发新的杏果实采后病害控制方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、菌种与试剂

赛买提杏，产自新疆库车县乌恰镇杏果园。

A. alternata由新疆农业大学采后生理研究室提供。

SA（分析纯） 天津市光复精细化工研究所；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、β-巯基乙醇、羟胺盐酸、95%乙醇、硼酸、硼砂、冰乙酸、甲醇（均为分析纯） 天津市福晨化学试剂厂；辅酶A、p-香豆酸、Leupeptin 上海生物工程股份有限公司；L-苯丙氨酸、NADPNa2、G-6-pNa、反式肉桂酸新疆宝信生物有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204-IC型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；XMTD-4000型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂；TU-1810型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 水杨酸处理方法

实验于库车县乌恰镇进行。选择光照、通风、生长势一致的杏树，采用单株随机组合试验设计，进行田间试验。实验共2 个处理，每个处理5 棵树，重复3 次，做好标记。在杏果实的坐果期、膨大期、转色期及采收前48 h采用1.0 mmol/L水杨酸（在预实验的基础上，筛选出采前SA对杏果实病害控制最佳的作用浓度为1.0 mmol/L）进行喷施，以喷施清水处理为对照（CK）。每个处理喷施20 kg，以树叶和果实全部喷湿为度。果实采收后12 h内运回新疆农业大学果蔬采后生理研究室，剔除伤、病果，选择大小、果色均匀、成熟度相近的杏果实置于4 ℃、相对湿度（relative humidity，RH）为90%～95%的冷库中贮藏待用。

1.3.2 孢子悬浮液的配制

参照Bi Yang等[11]方法并修改。取生长7 d的 A. alternata培养皿，用胶头滴管加入10 mL含有0.05% Tween-20的无菌水，用接种环轻轻刮下马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上的A. alternata孢子，然后倒入50 mL三角瓶中，将孢子悬浮液在微型旋涡混合器上振荡15 s，以混合均匀，之后再用双层纱布过滤。过滤后的孢子悬浮液用血球计数板记数并调节，使滤液中A. alternata的浓度达到1×106个/mL。

1.3.3 损伤接种A. alternata果实发病率及病斑直径的测定

实验全过程在无菌操作台中进行。取采前SA处理和对照的杏果实，先用70%酒精擦洗杏果实表面以进行消毒，再用经过灭菌的铁钉在杏果实中部刺孔1 个（直径3 mm、深度3 mm），向刺孔内注入15 μL的孢子悬浮液，随后用胶带在注射孔的上方粘贴出个空室，预防其他微生物的进入和保持局部湿度有利于病原菌的生长。接种完成后，将果实有孔的一面向上放置，整齐地置于塑料筐内，放置于4 ℃、90%～95% RH的冷库中贮藏，每7 d观察杏果实的接种发病率和测量病斑直径。利用十字交叉法测量病斑直径，以注射孔菌斑直径大于3 mm时即为接种发病果实。每处理用果20 个，重复3 次。果实接种发病率计算公式如下：

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性的测定

参照曹建康等[12]的方法。酶活性以每小时内吸光度变化0.01为1个活性单位（U）。酶活力单位为U/（h·g）。

1.3.5 4-香豆酰-辅酶A连接酶（4-coumarate: CoA ligase，4-CL）活性的测定

参照范存斐等[8]的方法。酶活性以每分钟吸光度变化0.01为1个活性单位（U）。酶活力单位表示为U/（min·g）。

1.3.6 肉桂酸羟化酶（cinnamate-4hydroxylase，C4H）活性的测定

参照范存斐等[8]的方法。酶活性以每小时吸光度变化0.01为1 个酶活性单位（U）。酶活力单位为U/（min·g）。

1.3.7 总酚和类黄酮的测定

参照Pirie等[13]的方法。分别在波长280 nm和325 nm波长处比色测定样品光密度（optical density，OD）值，总酚含量用OD280nm/g表示；类黄酮物质含量，即OD325nm/g表示。

1.3.8 木质素的测定

参照Morrison[14]的方法。在波长280nm处比色测定样品OD值，木质素含量以OD280nm/g表示。

2 结果与分析

2.1 采前SA处理对杏果实损伤接种A. alternata发病率及病斑直径的影响

图 1 采前SA处理对杏果实损伤接种A. alternnaattaa发病率的影响Fig.1 Effect of pre-harvest salicylic acid treatment on the incidence of disease in apricot fruits inoculated with Alternaria alternata

图 2 采前SA处理对杏果实损伤接种A. alternata病斑直径的影响Fig. 2 Effect of pre-harvest salicylic acid treatment on lesion diameter in apricot fruits inoculated with Alternaria alternata

如图1所示，对杏果实进行损伤接种A. alternata后，整个贮藏期间，杏果实接种发病率呈现不断上升的趋势，但SA处理组杏果实接种发病率始终低于对照组。在接种的第21天，对照组杏果实已开始发病，而SA处理组未见发病。在接种的第28天，对照组发病率为18.3%，而SA处理组则为5%，不及对照组的1/3。贮藏结束时，SA处理的果实发病率仅为对照的60.50%（P＜0.01）。同样，如图2所示，SA处理有效控制了果实病斑直径的扩展，接种后第35天和第42天病斑直径分别比对照低25.68%和24.60%（P＜0.01）。说明采前SA处理可以显著降低杏果实接种发病率和抑制病斑直径的增大，减轻病害的发生。

2.2 采前SA处理对杏果实PAL、C4H、4-CL活性的影响

由图3可以看出，对照组和处理组杏果实PAL活性都呈先上升后下降的趋势，但SA处理组杏果实PAL活性明显高于对照果实。在贮藏初期，采前SA处理组和对照组杏果实PAL活性迅速升高，并在贮藏第21天时各处理组PAL活性均达到最大值，SA处理组杏果实PAL活性为79.39 U/（h·g），对照组PAL活性为63.33 U/（h·g），SA处理组比对照组高了25.35%（P＜0.01）。随后，杏果实PAL的活性缓慢下降。说明采前SA处理对杏果实PAL活性的升高具有诱导作用。

图 3 采前SA处理对杏果实PAL活性的影响Fig.3 Effect of pre-harvest SA treatment on PAL activity in apricot fruits

图 4 采前SA处理对杏果实C4H活性的影响Fig.4 Effect of pre-harvest SA treatment on C4H activity in apricot fruits

如图4所示，杏果实的C4H活性在整个贮藏过程中呈缓慢上升的趋势且变化较为平稳，而采前SA处理能使C4H活性保持在相对较高的活性水平上。贮藏第28天时，SA处理和对照组的杏果实C4H活性分别为6.53 U/（min·g）和4.39 U/（min·g），SA处理组比对照组高了48.75%（P＜0.01）。结果说明SA处理能显著提高杏果实贮藏期间C4H的活性。

图 5 采前SA处理对杏果实4-CL活性的影响Fig.5 Effect of pre-harvest SA treatment on 4-CL activity in apricot fruits

贮藏期间杏果实4-CL活性的变化如图5所示，对照和SA处理的杏果实4-CL活性总体呈上升的趋势，但杏果实经SA处理后4-CL的活性始终高于对照。在贮藏的第21天和第42天，SA处理组杏果实的4-CL活性分别为0.61、0.96 U/（min·g），对照组杏果实4-CL活性为0.37 U/（min·g）和0.67 U/（min·g），对照组比处理组分别低了39.34%（P＜0.05）和30.20%（P＜0.01）。

2.3 采前SA处理对杏果实苯丙烷代谢产物积累的影响

图 6 采前SA处理对杏果实总酚含量的影响Fig.6 Effect of pre-harvest SA treatment on total phenolic contents in apricot fruits

酚类化合物是许多植物体本身的固有成分，也是植物的次生代谢产物，在植物的抗病机制中起着重要作用。由图6可以看出，杏果实总酚含量随着接种时间的延长而缓慢上升，但SA处理的杏果实总酚含量始终高于对照。其中贮藏第28天和第42天，SA处理组和对照组总酚含量差异最显著，SA处理杏果实总酚含量高出对照果实的20%（P＜0.01）。这表明采前SA处理可诱导杏果实总酚含量的积累。

图 7 采前SA处理对杏果实类黄酮含量的影响Fig.7 Effect of pre-harvest SA treatment on fl avonoid contents in apricot fruits

大量研究表明，在病原菌入侵后，宿主细胞检测到大量的类黄酮积累，因此可以把类黄酮作抗性鉴定的生化指标之一。本实验中类黄酮含量的测定结果如图7所示，贮藏期间杏果实类黄酮含量呈上升趋势。贮藏第21天时，SA处理组和对照组杏果实类黄酮含量均出现峰值，SA处理果实的类黄酮含量高出对照28.99%（P＜0.01）。贮藏第21～35天，杏果实类黄酮含量逐渐下降，从第35天起略有上升，到贮藏结束时，SA处理杏果实类黄酮含量比对照组高了16.73%（P＜0.01）。

如图8所示，在贮藏前期，采前SA处理组杏果实木质素含量不断上升，于贮藏第21天积累达到峰值，显著高出对照24.5%（P＜0.01）。在贮藏的第21～42天，SA处理组杏果实木质素含量逐渐下降。整个贮藏过程中，杏果实对照组木质素的含量趋于平稳，无明显的变化，且始终低于SA处理组杏果实木质素的含量。上述结果说明，在贮藏期间，采前SA处可提高杏果实中木质素的积累。

图 8 采前SA处理对杏果实木质素含量的影响Fig.8 Effect of pre-harvest SA treatment on lignin contents in apricot fruits

3 讨论与结论

苯丙烷代谢途径是植物最重要的次生代谢途径之一，由这一途径产生的木质素、酚类物质及类黄酮等次生物质在植物生长发育、抵御病虫害及构成植物支撑系统等方面具有重要意义。研究发现PAL、4-CL、C4H是该途径的关键酶系[15]。其中PAL是苯丙烷代谢途径中的调节酶和限速酶，参与合成酚类、植保素和木质素等抗菌物质，这些物质与植物的防卫反应及抗病性密切相关[16]。因此，植物PAL活性增高，有利于植物抗病性增强。4-CL处在总途径向分支途径的转折点，控制苯丙烷类化合物生物代谢向不同方向进行，在植物与病原微生物的相互作用中起必不可少的作用[17]。C4H与果实体内咖啡酸和阿魏酸等物质的合成前体p-香豆酸的合成密切相关，这些酚酸可直接毒杀病原物，对病原菌的生长繁殖产生抑制[18]。本实验结果表明，采前喷施SA处理显著降低了杏果实损伤接种发病率，抑制果实病斑直径的扩展，说明采前SA可以明显减缓杏果实采后病害的发生。与对照组相比，采前SA处理显著提高了杏果实PAL、4-CL和C4H的活性。邓惠文等[19]研究结果表明，苯并噻重氮（benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothioic acid S-methylester，BTH）处理甜瓜后有效降低了损伤接种T.roseum的病斑直径，提高了果实体内PAL、4-CL活性及总酚、类黄酮含量迅速增加，证明了4-CL以及总酚和类黄酮参与了甜瓜果实的抗病过程。Liu Yaoyao等[20]研究发现苯并噻二唑处理甜瓜，可以激活甜瓜果实体内苯丙烷代谢相关酶活性，从而加强果实细胞壁和防止病原入侵；由此可见，苯丙烷代谢途径关键酶的活性与果蔬的抗病能力密切相关。

总酚、木质素和类黄酮是苯丙烷类代谢途径的最终产物。酚类物质本身具有抗病性，可作为病原物的拮抗剂，同时又是合成木质素的前体，木质素作为植物细胞壁主要成分与纤维素共同作用可增强果实的表皮结构，从而提高其抗病性。类黄酮则是重要的植保素，可以抑制病斑的扩大及病原物在未侵染细胞中的扩展，其产生的速度和积累的量常常直接反映了植物抗病性的强弱[21]。本研究结果显示，采前SA处理增加了类黄酮、总酚和木质素的合成，从而增强了果实的抗病性。姜爱丽等[22]采用0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的SA对蓝莓果实进行浸泡处理，结果显示SA处理促进了蓝莓果实苯丙烷代谢的进程，从而使苯丙烷代谢的终产物——木质素的含量增加，进而增加了果实硬度并可有效地抵御微生物的入侵；陈年来等[23]在甜瓜叶片的研究结果表明经诱导剂BTH、SA处理和白粉菌接种后，伴随着甜瓜对白粉病系统抗性的增强，甜瓜叶片总酚与类黄酮含量显著增加。上述研究结果与本实验的结果均表明，SA等外源诱导剂可通过促进果蔬苯丙烷代谢进程，从而增强果蔬对病害的抗性。

综上所述，采前SA处理能够显著降低杏果实损伤接种A. alternata后的发病率及病斑直径，通过诱导杏果实苯丙烷代谢关键酶PAL、C4H和4CL活性的升高，促进总酚、类黄酮和木质素等抗性物质的积累，提高了杏果实对采后病害的抗性。

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Induction of Disease Resistance and Phenylpropanoid Metabolism in Apricot Fruits by Pre-Harvest Salicylic Acid Treatment

ZHAO Yating, ZHU Xuan*, MA Xuan, GUO Yangmeijuan
(College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, Ürümqi 830052, China)

Xinjiang apricot fruits (‘Saimaiti’ cultivar) were sprayed with 1.0 mmol/L salicylic acid at four growth periods: setting, enlargement, color-turning and 48 h before picking. The post-harvest apricot fruits were stored at 4 ℃, 90%–95% relative humidity (RH). The lesion diameter and the incidence of disease of apricot fruits inoculated with Altern aria alternata, the activities of phenylalanine ammonia-lyase (PAL), CoA ligase (4-CL) and cinnamate-4hydroxylase (C4H) and the contents of fl avanoids, lignin and total phenolics in apricot fruits were measured regularly. The effect of salicylic acid on phenylpropanoid metabolism in apricot fruits during storage period was studied. The results showed that the lesion diameter and disease incidence of apricot fruits during storage were signifi cantly inhibited by pre-harvest salicylic acid treatment. Besides, the activities of PAL, C4H and 4-CL and the contents of fl avonoids, lignin and total phenolics in apricot fruits were increased.

apricot fruits; salicylic acid; phenylpropanoid metabolism; postharvest diseases; induced resistance

TS255.3

A

1002-6630（2015）02-0216-05

10.7506/spkx1002-6630-201502042

2014-07-09

国家自然科学基金地区科学基金项目（31260408）

赵亚婷（1989—），女，硕士研究生，研究方向为果蔬贮藏与保鲜。E-mail：491770895@qq.com

*通信作者：朱璇（1971—），女，教授，博士，研究方向为果蔬贮藏与保鲜。E-mail：zx9927@126.com