感染性骨缺损动物模型的研究进展

王晓波(综述)，郑　欣 ，陈一心※(审校)

(1.东南大学鼓楼临床医学院骨科，南京 210008； 2.南京大学医学院附属鼓楼医院骨科，南京 210008)



感染性骨缺损动物模型的研究进展

王晓波1△(综述)，郑欣2，陈一心2※(审校)

(1.东南大学鼓楼临床医学院骨科，南京 210008； 2.南京大学医学院附属鼓楼医院骨科，南京 210008)

摘要：感染性骨缺损是指骨缺损的同时伴有感染而导致骨不愈合，其治疗是临床一大难题。近年来，随着生物载体材料的研究，感染性骨缺损的骨组织工程治疗方法不断深入，如何更好地建立感染性骨缺损模型对实验的研究有至关重要的作用。建立感染性骨缺损动物模型需要选择细菌种类及剂量、动物种类和骨缺损的部位，而不同的动物及骨缺损部位所需的细菌剂量不同，合适的选择对骨组织工程的研究结果影响极大。

关键词：感染；骨缺损；动物模型

随着交通事故的频繁发生，各种开放性骨折日益增加，由于其通常伴有感染和骨缺损而导致骨不愈合，其治疗是骨科临床中的一大难题[1-3]。感染性骨缺损是指骨缺损的同时伴有感染，其病因和治疗是目前矫形外科的研究热点。感染性骨缺损动物模型的建立为其提供了有效的研究方法，可为感染性骨缺损的临床治疗提供指导和依据。目前大多数实验采用在慢性骨髓炎模型的基础上清创制造骨缺损的方法构建感染性骨缺损模型[4-6]。现就感染性骨缺损动物模型的研究进展予以综述。

1感染性骨缺损动物模型的细菌种类

1.1金黄色葡萄球菌人类骨感染中，以金黄色葡萄球菌最为多见[7-8]，因此感染性骨缺损动物模型最常采用金黄色葡萄球菌[9-11]。根据来源不同，可直接使用在患者感染部位分离出的菌株，Lucke等[12]在慢性骨髓炎患者体内分离出对氟氯霉素、庆大霉素和红霉素敏感但对青霉素有耐药性的金黄色葡萄球菌用于制作鼠感染性骨缺损模型。而更多人则采用标准的美国模式培养物集存库(ATCC)菌株，常用的有ATCC29213[13-14]、ATCC49525[5-15]、ATCC25923[9,16]、ATCC33591(即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)[10,17]等。李云飞等[17]在国内率先使用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌制作新西兰大白兔胫骨慢性骨髓炎模型，模型成功率为92.5%，表现为慢性活动性炎症，效果较满意。Xing等[9]在新西兰兔胫骨结节用3 mm克氏针钻孔注入金黄色葡萄球菌ATCC25923，4周后即出现死骨形成、骨膜反应、骨质破坏、骨硬化、软组织肿胀等骨感染表现。在实验前确定细菌的正确剂量尤为必要，否则可能导致感染率低或细菌数量太多，毒血症反应严重，动物病死率高[4]。不同动物、不同部位所需细菌接种量不同[13-17]。Horn等[18]制备兔胫骨感染性骨缺损模型时，使用4×104菌落形成单位(Colong forming unitsk,CFU)金黄色葡萄球菌，所有的动物均未形成感染；当使用6×106CFU 细菌剂量，所有动物均出现严重的骨感染症状。唐辉和徐永清[13]选用6月龄新西兰大白兔在其胫骨骨面，以3 mm 克氏针钻孔制备0.5 cm×0.5 cm骨窗，注入不同浓度的ATCC29213，探讨细菌注射量与感染进程的关系；结果发现，金黄色葡萄球菌注射剂量≥6×105CFU可出现明显的放射学和细菌学改变，而<6×104CFU则只有轻微感染，因此认为6×105CFU可作为兔胫骨慢性感染性骨缺损模型制备适合剂量。Chen等[19]在大鼠股骨制造6 mm骨缺损后，分别接种1×103、1×104、1×105、1×106CFU的金黄色葡萄球菌，接种2个月后只有1×104CFU能较好地形成节段性骨缺损感染模型且不影响固定装置的稳定性，4周后1×105、1×106CFU固定装置稳定性受到明显影响而1×103CFU感染率较低。然而，Passl等[20]认为细菌浓度的影响有限，细菌及其产物能改变感染部位的微环境促进细菌增殖，他们用1×104CFU的金黄色葡萄球菌即成功地在豚鼠股骨建立感染性骨缺损模型。同样的，Lindsey等[4]发现，大鼠股骨接种细菌量在1×102CFU金黄色葡萄球菌即能达到理想的90%~100%的感染率且不会发生败血症。

1.2大肠埃希菌和铜绿假单胞菌临床中还可见其他微生物感染的骨感染(如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等)。为验证大肠埃希菌是否具有与金黄色葡萄球菌相同的诱导骨感染的能力，Passl等[20]用电锯截断7只豚鼠股骨，接种1×105CFU大肠埃希菌，4周后出现明显的骨感染表现，90 d后细菌学检查6只豚鼠无细菌感染，1只有大肠埃希菌和铜绿假单胞菌混合感染，表明细菌产物导致的局部炎症反应、内毒素和免疫微环境变化等可促进其他细菌进入感染部位。Kanellakopoulou等[21]从慢性骨髓炎患者分泌物中分离出铜绿假单胞菌，在31只兔胫骨上段接种，制作感染性骨缺损动物模型，接种细菌2周后局部出现肿胀，16只兔有化脓性窦道形成，49 d后只有25只兔出现骨感染表现并伴有死骨形成，其余11只无明显感染。该研究表明，铜绿假单胞菌也可作为制作感染性骨缺损模型的菌种，但其模型的成功率较低。

1.3混合细菌临床患者常出现混合感染，为模拟混合细菌感染的动物模型，Lambe等[22]使用表皮葡萄球菌和脆弱类杆菌混合感染兔胫骨后，使用电子显微镜观察发现，表皮葡萄球菌主要分布在植入物表面，而脆弱杆菌主要分布于骨和骨髓。袁军等[23]用金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌混合感染大鼠，发现低浓度的两种细菌之间存在协同作用；在局部细菌水平低的情况下，铜绿假单胞菌可以增强金黄色葡萄球菌的致病性。

2动物种类

2.1大鼠尽管大鼠骨骼尺寸较小，但仍可进行钻孔、截断和内、外固定等操作。Henry和Galloway[24]认为，大鼠比较适合用于感染性骨缺损的研究，因为其有相对经济和耐受广谱抗生素治疗等优点；但鼠的体积小，不能用于大型固定装置的测试并且难以控制性静脉使用抗生素。Kaya等[11]应用大鼠胫骨感染性骨缺损模型，在大鼠胫骨平台和胫骨结节之间用旋钻做一深度约为1 cm的骨缺损管道，然后注入1×105CFU金黄色葡萄球菌100 μL；2 d后大鼠胫骨部位出现明显的红肿热痛表现，约21 d后大鼠胫骨X线可见软组织肿胀、骨亮度增强、骨组织破坏、骨膜反应及皮质骨溶解等骨感染表现，每克骨组织的细菌数量达51×105CFU。Hamblen[25]发现大鼠胫骨感染性骨缺损模型中，仅接种细菌时感染率较低，约为64%，但开放接种并置入外科血纤维泡沫后，其感染率可达85%。大鼠股骨还可制作节段性感染性骨缺损模型，Penn-Barwell等[15]用电锯从股骨中段截断6 mm，接种1×102CFU 金黄色葡萄球菌和60 mg/mL牛血清蛋白0.5 mL，模拟开放骨折的感染机制，成功建立节段性感染性骨缺损动物模型。

2.2兔An等[26]认为，新西兰大白兔体形适中、价格便宜且胫骨前仅有皮肤覆盖，手术操作方便，适宜作为骨感染研究的模型动物。此外，兔的长骨具有更容易感染的特点，且兔骨骼尺寸相对较大，可作为感染性骨缺损的部位也较多，每个部位有着各自的优缺点[27]。兔颅骨较厚，其板状骨比较适合建立骨缺损面积较大的模型，Smith等[28]在兔颅骨建立15 mm×15 mm的大段骨缺损模型，观察6周后，骨缺损无明显修复。刘冰和陈鹏[16]在兔颅骨上制成直径为10 mm的颅骨全层缺损区，缺损区植入β-磷酸三钙，在每块植入物上均匀滴加1.5×108CFU/mL金黄色葡萄球菌液l mL，手术成功率为100%；术后2周缺损区软组织有明显肿胀及脓性渗出，并有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润和微小脓肿形成等骨感染表现。兔颅骨还可在左右侧各建立骨缺损模型进行自身对照，Yew等[29]在兔颅骨左右各钻一直径为8 mm的颅骨全层缺损区，用于对比研究自体间充质干细胞对于骨缺损的修复。兔胫骨最早用于建立感染性骨缺损模型，具有手术暴露简单且骨缺损断端稳定性好等优点[30]。Borzsei等[31]在胫骨近端前面作一4 mm×8 mm的骨缺损，接种1×109CFU金黄色葡萄球菌，并将自体失去活性的骨碎片植入骨髓腔促进感染；4周后，6只兔死于感染并发症，19只兔成功建立感染性骨缺损模型。高秋明等[32]在胫骨近侧干骺端内侧1.5 cm处制作长半环形骨缺损并接种细菌制作骨髓炎模型，4周后仅能观察到骨质疏松，8周后才能观察到化脓性窦道、死骨形成等骨感染表现。相对于胫骨，股骨能更好地承载植入物。Schroeder等[10]在6只新西兰大白兔距髌股关节背侧5 mm处和膝关节5 mm处的中心，制成一直径4 mm的骨缺损，接种金黄色葡萄球菌，并将直径4.1 mm、长5 mm表面钛涂层的圆柱状植入物植入胫骨远端；通过细菌学检查等方法观察到，约7周后，5只兔可见细菌培养阳性、化脓性窦道等骨感染表现，1只死于脓毒性血症。兔前臂桡骨和尺骨解剖学融合在一起，可以比较完整地进行截骨手术建立节段性骨缺损模型，而不需要内固定或外固定，这种模型较为接近人类的感染性骨缺损的临床实际[33]。Evans等[34]用电锯在新西兰兔桡骨中段截取1 cm制造节段性骨缺损，接种1×108CFU金黄色葡萄球菌，用死骨促进感染，约4周后感染性骨缺损模型成功率为93%。李东亚等[33]采用计算机断层扫描研究分析6月龄兔桡骨大段骨缺损模型的合理骨缺损长度及缺损位置，结果表明，兔桡骨大段骨缺损模型的缺损长度选择1.5 cm较为合适，且缺损位置选择在桡骨中段或者近段均可。

2.3犬和猪大型实验动物昂贵、实验饲养要求高、手术操作难度大，但也有很多优点(如与人的生物同源性近、体积大等)。Wahlig等[35]建立了经典的犬股骨感染性骨缺损模型，在股骨转子窝钻孔后吸取2 mL骨髓，将1×108CFU的金黄色葡萄球菌注入骨髓腔，5~7周后出现溶骨反应等骨感染表现，建模的成功率为58.3%。Patterson等[36]在8只猪下颌骨钻孔，用电烙术制造骨坏死，然后向骨髓腔内注入金黄色葡萄球菌1×109~1×1010CFU，8周后所有实验动物均有溶骨反应、化脓性窦道形成等骨感染临床表现。

3小结

在研究感染性骨缺损发病机制及治疗方法的过程中，很多学者采用多种方法在大小动物中建立了感染性骨缺损的动物模型，如何更好地制备感染性骨缺损的动物模型仍需要大量实验研究。感染性骨缺损手术的选择方式(如：先制作骨感染再行清创术形成缺损、先做缺损再感染等)、术中是否加入易感染因素(如：加入死骨、开放伤口、软组织破坏等)等均对感染性骨缺损动物模型建立的成功率有至关重要的影响。随着研究的深入，相信会有更为理想的模型，进一步推动感染性骨缺损发病机制和有效治疗方法的探索。

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Advancement of Animal Models for Infective Bone Defect

WANGXiao-bo1,ZHENGXin2,CHENYi-xin2.

(1.DepartmentofOrthopedics,DrumTowerClinicalMedicalSchoolofSoutheastUniversity,Nanjing210008,China; 2.DepartmentofOrthopedics,DrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China)

Abstract:The infective bone defect refers to the situation of bone defect combined with infection which results in the nonunion of the bone,and the treatment is still a difficulty in clinical.In recent years,along with the research of biological carrier material,the bone tissue therapeutic method for the infective bone defect has been continuously deepening,and developing an appropriate animal model is very important for thestudy.While considering a specific model,one should take the bacterial species,bacteria groups and numbers,and bone defect site into account.Different bacteria amounts are needed for different animals and positions,and appropriate choices have significant impact on the study result.

Key words:Infection; Bone defect; Animal model

收稿日期：2014-06-05修回日期：2014-08-23编辑：郑雪

基金项目：江苏省社会发展基金(BE2011604)；江苏省六大人才高峰项目(2012-WS-092)；南京市卫生局一般项目(YKK13079，ZKX12016)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.07.003

中图分类号：R332

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)07-1158-04