亚洲玉米螟几丁质合成酶B (CHSB)启动子序列克隆与分析

杨 晨 ，鲁 新，王振营，席景会，潘怡欧，毕 锐，彭天飞，尚庆利*

(1.吉林大学植物科学学院，长春 130062;2.吉林省农业科学院植物保护研究所，吉林公主岭 136100;3.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100186)

亚洲玉米螟是一种主要为害玉米的重要的农业害虫，主要分布在亚洲东部和澳洲(王振营等，2000)。其环境适应性强，生活的纬度跨越大，能够适应从潮湿到干旱、寒冷到炎热的绝大部分地区。因为寄主不同和生活的环境不同，亚洲玉米螟相应的生长状态，如体重、大小、年发生代数都不尽相同(杜益哉和杨顾新，1985;谢为民，1989;胡明峻和孙伯欣，1979)。在我国，亚洲玉米螟主要分布在北至黑龙江，南至广东的广大区域。亚洲玉米螟寄主极为广泛，除取食玉米外，还侵害包括常见的农作物有水稻、棉花、高粱、谷子等几十种不同的农作物(王振营等，2000)。防治亚洲玉米螟通常采用化学农药、选育抗性品种和天敌防治的方法。近年来，生物技术得到长足发展，也为玉米抗螟品种的培育提供了新的方法。例如将Bt 毒蛋白基因和蛋白酶抑制剂基因转入玉米从而分别得到转基因作物(丁群星等，1993;王国英等，1995)。但推广转基因作物困难重重，再加上传统化学防治的过程中，亚洲玉米螟又会不断的产生抗性。因此，亟待寻找一种新型的环境友好型的防治亚洲玉米螟的方法。昆虫几丁质合成酶是昆虫蜕皮和变态发育过程中几丁质生物合成的关键酶，同时也是潜在的环境友好杀虫剂的理想靶标。

几丁质是一种由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)以β-1，4 糖苷键连接而成的线性多糖。几丁质在真菌、线虫和节肢动物中都有发现，而昆虫几丁质是昆虫体壁与中肠的围食膜的重要组成成分，围食膜可以保护昆虫减少食物以及入侵微生物对中肠造成的机械损害(Hegedus et al.，2009)。

几丁质的形成大致可分为三个不同的步骤(Merzendorfer，2006)。在第一步骤中，酶催化结构域形成聚合物;第二个步骤，新生的聚合物通过膜转移并释放到细胞外空间;最后一步完成单聚合物自发组装形成结晶微纤维。在随后的反应中微纤维与其他糖类、蛋白质、糖蛋白结合形成真菌隔膜和细胞壁以及节肢动物的角质层和围食基质。这个过程在甲壳纲动物和昆虫中最为常见。几丁质合成酶与几丁质的合成密切相关，它属于糖基转移酶的第二家族。几丁质的合成需要UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)作为底物和二价阳离子作为辅因子。迄今为止，已发现的几丁质合成酶共有两种，它们分别是几丁质合成酶A (CHSA)、几丁质合成酶B (CHSB)(Merzendorfer，2006)。这两种酶的基本属性非常相似，分子量都在170 kDa 左右，都包含有3 个结构域:N-末端跨膜结构域，一个中央催化结构域和C-末端跨膜结构域。不同之处在于，CHSB 比CHSA 略短，具有较低的等电点，因此编码的蛋白质也略小一些。它们功能表达的区域也并不相同，CHSA 主要合成昆虫表皮的几丁质(Arakane et al.，2008)，而CHSB 在围食膜的形成阶段表达(Arakane et al.，2005;Bolognesi et al.，2005;Kumar et al.，2008)。实验证明，当抑制CHSB 合成几丁质的表达时，昆虫将会因为饥饿而导致死亡(Arakane et al.，2005)。本研究考虑通过研究CHSB 基因的启动子，找出控制亚洲玉米螟中肠围食膜几丁质合成酶表达的核心元件，并分析该基因可能的转录调控途径，寻找可能的靶点。

1 材料与方法

1.1 试虫

收集实验室人工饲养的亚洲玉米螟3 龄幼虫，经液氮处理后冻入-80℃冰箱。

1.2 亚洲玉米螟基因组DNA 的提取以及前期准备

利用DNAiso Reagent (TaKaRa)试剂盒提取亚洲玉米螟基因组DNA。用6种不同的平末端内切酶(BstZ17I、PmeI、PsiI、PvuII、SmaI、SnaBI、StuI)分别消化基因组DNA。然后，再将消化后的片段按照DNA Genome WalkerTMUniversal Kit (Clonech)的步骤进行纯化。最后，我们将已纯化的DNA 片段分别连接上接头引物。

1.3 染色体步移引物的设计及目的片段的PCR扩增

依据亚洲玉米螟 B 型几丁质合成酶(OfCHSB)序列(GeneBank ID:DQ 294306)设计两个反 特异性 物 GSP1 (5'-GTGATGAAGAGCAGGGTGCCTTTACA-3') 和GSP2 (5'-TTTCAGTATCGGATTCATCGCTGTCAC-3')，分别与用引 AP1 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3')、AP2 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3')配对使用。染色体步移总共需要进行两轮PCR 反应，以AP1、GSP1为引物进行第一轮PCR，然后以第一轮PCR 产物稀释50 倍为模板，AP2、GSP2 为引物进行第二轮特异性PCR 扩增。PCR 程序参考试剂盒说明书。

1.4 目的DNA 的pGEM-Teasy 载体连接与转化

以不同内切酶处理获得的DNA 为模板进行PCR 扩增并回收目的片段，回收产物与pGEM-Teasy 载体连接、转化。选取阳性单克隆37℃扩大培养，并提取质粒进行测序。

2 结果与分析

2.1 染色体步移法扩增未知序列

用设计好的特异引物和处理好的玉米螟DNA进行两轮特异性PCR，目的产物被特异性扩增。第二轮PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳显示，只有经过平末端内切酶BstZ17I 处理后的DNA 片段经PCR扩增后，在1 kb 和2 kb 之间得到一条特异性条带(图1)。测序结果显示该DNA 片段为OfCHSB 基因5'端侧翼序列。

图1 染色体步移法第二轮PCR 琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 The agarose gel electrophoresis of the second round PCR of genome walker

2.1 OfCHSB 启动子序列及分析

用启动子分析软件 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析了启动子的核心元件及可能的转录因子结合位点。利用在线软件(http://www.fruitfly.org/seq_ tools/promoter.html)预测转录起始位点。在序列表中，转录起始位点的碱基用+1 示出，起始密码子ATG 用加粗标注。测序结果显示，从BstZ17I 消化后的DNA 中扩增得到1484 bp 的DNA 片段，分析显示该片段为OfCHSB 基因5'端序列。其中，OfCHSB 的开放阅读框从+348 开始，启动子包含的序列是﹣1082 至+347，转录起始位点从+1 开始。如图所示，通过分析显示6种转录因子(GATA-1、C/EBPalpha、Oct-1、Dfd、CREB、ER)可能参与OfCHSB 的转录调控，其在DNA 上的结合位点如图所标示。+116 至+127 (CREB)、+120至+131 (ER)和+292 至+302 (Oct-1)区域可能是该启动子的核心顺式元件。

DNA 序列区域+348 至+402 (粗体)是OfCHSB 基因5'端的编码区，-1082 至+1 是OfCHSB 基因启动子序列。+1 表示OfCHSB 的转录起始位点，标注有下划线的序列是可能的启动子上的顺式元件(见图2)。

3 结论与讨论

亚洲玉米螟几丁质合成酶的研究中，CHSA 很可能存在两个通过选择性剪接的异构体，即OfCHSA-2a 和OfCHSA-2b (Qu and Yang，2011)，它们分别受两个独立的启动子控制。其中OfCHSA-2a 在玉米螟生长和发展阶段起作用，主要是在幼虫-幼虫蜕皮和幼虫-蛹转化，以及在产卵期间表达，而OfCHSA-2b 仅在幼虫-幼虫蜕皮时表达。由此可见启动子对昆虫几丁质合成酶的产生有很大的影响。

在昆虫生长的不同时期，产生几丁质合成酶的过程受到启动子的调控。CHSB 在围食膜的形成阶段表达 (Arakane et al.，2005;Kumar et al.，2008)。当抑制CHSB 合成几丁质的表达时，昆虫将会因为饥饿而导致死亡(Arakane et al.，2005)。假如能够找出控制昆虫生长发育过程当中至关重要的基因上的启动子中核心元件，就有可能找到一种抑制该启动子活性的安全快捷的方法，从而为开发基于该策略的亚洲玉米螟防治新方法提供理论基础。实验中，我们用染色体步移方法得到了全长接近1500 bp 的OfCHSB 5'端侧翼序列，预测了OfCHSB 的转录起始位点并分析了该基因启动子的核心元件及可能的转录因子结合位点。分析显示6种转录因子(GATA-1、C/EBPalpha、Oct-1、Dfd、CREB、ER)可能参与OfCHSB 的转录调控。在家蚕BmUSP 基因中，转录因子Dfd 能够调控该基因合成蜕皮激素，从而对家蚕的发育产生影响(Huang et al.，2014)。CREB 是一种亮氨酸拉链因子(bZIP)，亮氨酸拉链是蛋白质中一种常见的三维结构模体，常见于许多转录因子的DNA 结合结构域，因此涉及基因的表达调控。研究表明，在果蝇Myc 基因中的CREB 能够调控该基因表达起到抑制多聚谷氨酰胺蛋白的毒性的作用，并可以被用来作为一种潜在的药物靶标作用于多聚谷氨酰胺疾病(Singh et al.，2014)。ER 是锌指蛋白(Zinc finger)的一种，锌指是在很多蛋白中存在的一类具有指状的结构模体，这些具有锌指结构的蛋白大多都是与基因表达的调控有关的功能蛋白。在对东亚飞蝗的研究中，存在于LmSPC1 基因上的ER I 型信号肽酶亚基对东亚飞蝗的生存至关重要，影响其蜕皮、取食、生殖和胚胎发育等诸多方面。因此，该ER 转录因子能够调控LmSPC1 基因的表达(Zhang et al.，2014)。Oct-1 是含有POU 结合域的一种转录因子并参与目的基因的转录调控。研究发现，同属于POU 结构域的两个同源异构型转录因子Oct-1 和Oct-2 能够转录调控鸡免疫球蛋白基因的表达，从而影响其免疫功能 (Petryniak et al.，1990)。结合Dfd、CREB、ER、Oct-1 在不同生物体中对相关基因发挥的转录调控作用，我们可以推测在亚洲玉米螟OfCHSB 基因中，这些结合位点同样可能起着转录调控的作用。对该启动子序列分析表明，该序列包含了完整的启动子序列和OfCHSB 序列5' 端的一段序列，这是一个新的亚洲玉米螟OfCHSB 的启动子序列。曾有研究人员获得了约500 bp 的亚洲玉米螟OfCHSB 启动子序列(Qu et al.，2011)，但与本研究得到的启动子序列并不完全一致，这有可能是编码同一种蛋白的不同拷贝型。基于这段完整的启动子序列和预测得到的启动子核心元件，我们可以进一步进行该序列的功能验证并找出其调控途径，从而为亚洲玉米螟的防治提供理论依据。

图2 OfCHSB 基因启动子和部分5' 端的编码区序列Fig.2 OfCHSB promoter and part of the 5 ' end of the coding sequence

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