多重耐药鲍曼不动杆菌的主动外排泵基因对β-内酰胺类抗菌药物耐药性的影响*

孙静娜，杨继章，王国欣，赵帅，刘泽世，张征

(河北医科大学第一医院1.检验科；2.药学部，石家庄 050031)

多重耐药鲍曼不动杆菌的主动外排泵基因对β-内酰胺类抗菌药物耐药性的影响*

孙静娜1，杨继章2，王国欣1，赵帅1，刘泽世1，张征1

(河北医科大学第一医院1.检验科；2.药学部，石家庄 050031)

目的 探讨对β-内酰胺类抗菌药物耐药的多重耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵基因在耐药机制中表达情况。方法 多重耐药鲍曼不动杆菌96株，分析其对9种β-内酰胺类抗菌药物的耐药性。以加入泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)后最低抑菌浓度(MIC)降低至≤1/4为标准，筛选出34株外排泵表型阳性的鲍曼不动杆菌，用聚合酶联链反应(PCR)扩增法对其行外排泵蛋白基因adeB进行检测和分析。结果 多重耐药鲍曼不动杆菌对头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为92.3%，86.6%，83.0%，70.8%，68.3%；对氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦的耐药率分别为90.1%，77.5%，72.4%和67.3%。34株外排泵表型阳性的鲍曼不动杆菌检测到adeB基因有33株，检出阳性率97.06%。对33株鲍曼不动杆菌的外排泵基因adeB进行测序，经比对所测序列与Genebank中序列同源性为100.0%。结论 主动外排泵基因是多重耐药鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的一个重要因素。

鲍曼不动杆菌；多重耐药；外排泵；β-内酰胺酶

多重耐药鲍曼不动杆菌在住院患者，尤其在重症监护室、严重烧伤病房的耐药菌株的出现，给临床抗感染治疗带来很大困难。其中，多药外排系统是鲍曼不动杆菌多重耐药的一个重要原因。特别是AdeABC外排泵参与了鲍曼不动杆菌对氨基苷类药物、β-内酰胺类药物、氯霉素、红霉素和四环素的耐药。笔者通过96株多重耐药鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药性进行分析，探讨鲍曼不动杆菌主动外排泵基因adeB在其耐药机制中的作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 本实验所用菌株来自2012-2013年河北医科大学第一医院不重复菌株96株，其中来自下呼吸道标本76株，尿道分泌物标本11株，血液标本4株，尿液标本3株，炎性分泌物标本2株。进行纯培养后，经法国梅里埃公司Vitek32全自动微生物检测仪鉴定为鲍曼不动杆菌。

1.2 试剂 药敏纸片：头孢他啶(CAZ，每片30 μg)、 头孢哌酮/舒巴坦(SCF，每片75或10 μg)、头孢噻肟(CTX，每片30 μg)、头孢吡肟(CPR，每片30 μg)、头孢曲松(CRO，每片30 μg)、氨苄西林(AMP，每片10 μg)、哌拉西林(PIP，每片100 μg)、氨苄西林/舒巴坦(SAM，每片各10 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP，每片100/10 μg)。K-B法药敏纸片均为英国OXID公司产品。

AST-GN 药敏卡和GN鉴定卡(法国生物梅里埃公司产品)，泵抑制剂羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone，CCCP)和泵抑制剂溶解试剂二甲亚砜(河北博世林公司)，引物合成 adeB(委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，DNA提取 Maxwell®16 Cell LEV DNA Purification Kit 试剂盒(Promega公司)，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增 GoTaq®Green Master Mix、GoTaq®Colorless Master Mix(美国Promega公司)，DNA染色剂 Goldview，DNA Ladder Marker(北京赛百盛公司)，琼脂糖X-gal(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.3 仪器 MaxweII-16核酸提取仪(美国Promega公司)；Mini-4K/6K 微型离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；AB 9700PCR扩增仪(美国AB公司)；DYY-12电泳仪(北京六一仪器厂)；VilBer LouRMAT凝胶成像系统(法国VILBER LOURMAT公司)；SIGMA 3-18K台式冷冻离心机(德国Sigma公司)。

1.4 方法

1.4.1 药敏实验 按照2012年M02-A11临床实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的Kirby-Bauer法，对CAZ、SCF、CTX、CPR、CRO、AMP、PIP、SAM、TZP进行药敏实验。

1.4.2 外排泵表型阳性鲍曼不动杆菌的判定 参考Sylvia Valdezate方法，比较应用CCCP前后，96株多重耐药鲍曼不动杆菌对抗菌药物最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的变化，以加入泵抑制剂后MIC值比不加泵抑制剂降低至≤1/4作为外排泵表型阳性的判定标准。

1.4.3 外排泵蛋白基因adeB的检测 采用PCR技术检测外排泵蛋白基因adeB。adeB基因PCR引物的设计：根据GenBanK中已发布的各型基因序列[1]，自行设计基因引物，扩增产物长度约541 bp，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

引物A：5′-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3′(货号：AF370885)，引物B：5′-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3′(货号：AF370885)。

1.4.4 电泳 缓冲液0.5×TBE，电压100 V。上样标本量8 μL，DNA分子量Maker(100 bp)8 μL，电泳50 min置于全自动凝胶图像成像仪上观察结果并摄像，出现与目的基因片段分子相当的条带判为阳性。

1.4.5 adeB基因测序 将PCR扩增产物和切下的含阳性DNA的凝胶送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。

2 结果

2.1 96株鲍曼不动杆菌对9种β-内酰胺类抗菌药物的耐药情况 见表1。

表1 96株鲍曼不动杆菌对9种β-内酰胺类抗菌药物的耐药情况

2.2 96株多重耐药鲍曼不动杆菌对9种β-内酰胺类抗菌药物MIC的变化 加入泵抑制剂CCCP后，MIC值比不加泵抑制剂降低至≤1/4作为外排泵表型阳性的判定标准，筛选出外排泵表型阳性菌34株。

2.3 adeB基因的检出情况 34株鲍曼不动杆菌检测到adeB基因的有33株，检出率为97.06%。

2.4 adeB基因测序结果 取正反向双向测序结果一致的序列作为参比序列，应用NCBI中BLAST程序比对序列。adeB基因测序结果见图1。

2.5 基因序列比对 经比对所测序列与Genebank中序列同源性均为100.0%，未发现基因变异现象。

3 讨论

鲍曼不动杆菌基因组研究发现，其具有快速获得和传播耐药性的能力，多重耐药、广泛耐药、全耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行趋势，是目前我国最重要的“超级细菌”，也对全球抗感染领域提出挑战。由于鲍曼不动杆菌经常可以从各类标本中分离出来，所以成为引起院内感染的最为重要的机会致病菌。鲍曼不动杆菌通过酶机制、外排泵、抗渗性等极容易形成耐药菌株[2]。主动外排泵由菌体细胞膜表面蛋白组成，可以将进入细菌体内的药物排到细胞外，外排泵的过度表达可以引起鲍曼不动杆菌耐药性改变[3]。adeABC外排泵系统是引起鲍曼不动杆菌多重耐药的重要因素[4]。

笔者选取常用的3种第3代头孢菌素(头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松)和1种第4代头孢菌素(头孢吡肟)，结果显示第4代头孢菌素的耐药率较第3代头孢菌素的耐药率略低，但鲍曼不动杆菌对4种头孢菌素的耐药率均较高，提示临床医生在针对鲍曼不动杆菌感染时，一定要根据药敏实验结果选择抗菌药物。依据《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》中制定的鲍曼不动杆菌感染的抗菌治疗原则，选用含β-内酰胺酶抑制药舒巴坦、他唑巴坦的复合制剂，如氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦等，对于严重感染者可根据药敏结果与米诺环素、阿米卡星等药物联合使用。目前，国内鲍曼不动杆菌感染单用β-内酰胺类抗菌药物已显无效。

当鲍曼不动杆菌携带转座子介导的bla(TEM-2)或携带AmpC酶时，都会引起菌株对青霉素类药物的耐药，而选用含β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦、他唑巴坦的复合制剂，如氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦时，其耐药率也较高，表明鲍曼不动杆菌对含酶抑制剂的抗菌药物仍表达为耐药，临床治疗效果难以保证，这也显示外排泵基因的高度表达，可将进入细胞内的抗菌药物主动泵出可能是其耐药的重要因素，而不是β-内酰胺酶。

本实验筛选出34株鲍曼不动杆菌，在加入CCCP后，9种抗菌药物MIC值均明显降低；34株鲍曼不动杆菌可能由于外排泵的存在而产生耐药，说明CCCP对逆转鲍曼不动杆菌耐药行之有效。

主动外排机制使药物非特异性排出，导致多重耐药鲍曼不动杆菌的出现。AdeABC外排泵是鲍曼不动杆菌最主要的外排系统。AdeABC外排泵由在染色体上按顺序排列的结构基因adeA、adeB、adeC编码的膜融合蛋白AdeA、外排蛋白AdeB、外膜通道蛋白AdeC形成的三联体组成[5]。约80%的鲍曼不动杆菌含有adeABC操纵子，从而控制adeABC的过度表达，降低喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基苷类药物的敏感性[6]。于翠香等[7]也认为，多重耐药鲍曼不动杆菌携带外排泵基因，可能是这些菌株高耐药原因之一。

本研究通过对34株外排泵表型阳性鲍曼不动杆菌进行AdeABC外排泵的跨膜组件AdeB基因测定，检测到adeB基因有33株，检出阳性率较高，表明主动外排泵基因是多重耐药鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的一个重要因素。取正反向测序结果一致的序列作为参比序列，应用NCBI中BLAST程序比对序列，经比对所测序列与Genebank中序列同源性均为100.0%，未发现基因变异现象。表明AdeABC外排泵机制在鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性尤其重要。含有adeB基底泵的重组衍生体，相对于不含adeB基底泵抗菌药物的敏感性降低。此外，结构基因的失活，尤其是编码转录蛋白的adeB，外排泵活性的增强以及不同的外排泵之间相互作用，外排泵抑制剂在鲍曼不动杆菌对不同抗菌药物耐药性逆转中的应用仍有待研究。

本实验研究了β-内酰胺类抗菌药物作用于多重耐药鲍曼不动杆菌的靶位、细菌产生耐药性的因素及耐药机制，可为做好预防细菌产生耐药性、提高临床β-内酰胺类抗菌药物使用效率提供参考，同时为研制开发新的抗菌药物提供参考。

[1]HOU P F，CHEN X Y，YAN G F，et al.Study of the correlation of imipenem resistance with efflux pumps AdeABC，AdeIJK，AdeDE and AbeM in clinical isolates ofAcinetobacterbaumannii[J].Chemother，2012，58(2)：152-158.

[2] 宋彩虹，陆水英，张秀瑜，等.鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性及同源性分析[J].中国微生态学杂志，2013，25(2)：161-164.

[3] 佘婷婷，沈继录，徐元宏，等.泛耐药鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物机制研究[J].安徽医科大学学报，2012，47(3)：274-278.

[4] 王玮玮，王厚照，张玲.adeABC 基因对鲍曼不动杆菌耐药性的影响[J].国际检验医学杂志，2013，34(9)：1069-1070.

[5] 刘嘉，申恒巧，刘汉清.鲍曼不动杆菌的多重耐药性与主动外排系统[J].医药导报，2011，30(9)：1191-1193.

[6] COYNE S，GUIGON G，COURVALIN P，et al.Screening and quantification of the expression of antibiotic resistance genes inAcinetobacterbaumanniiwith a microarray[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54(1)：333-340.

[7] 于翠香，傅爱玲，王英田，等.多重耐药鲍曼不动杆菌抗菌制剂外排泵基因研究[J].中国抗生素杂志，2013，38(8)：629-632.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.009

Effects of the Active Efflux Gene on Multidrug Resistance ofAcinetobacterBaumanniito Beta Lactam Antibiotics

SUN Jingna1,YANG Jizhang2,WANG Guoxin1,ZHAO Shuai1,LIU Zeshi1,ZHANG Zheng1

(1.ClinicalLaboratory;2.DepartmentofPharmacy，theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031，China)

Objective To investigate the effect of expression of active efflux gene on multidrug resistantAcinetobacterbaumanniiin the course of resistance to beta lactam antibiotics. Methods Drug resistance of 96 strains of multidrug resistantAcinetobacterbaumanniito nine beta lactam antibiotics was analyzed.A total of 34 efflux phenotype positive strains were isolated according to the standard that the MIC level was reduced by more than 75 percent when the carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone inhibitors were added.The efflux pump protein gene adeB was detected, analyzed and sequenced by the method of PCR amplification. Results The antibiotic resistance rate to cefotaxime, cefiazidime，ceftriaxone，cefepime, cefperazone/sulbactam were 92.3%，86.6%，83.0%，70.8%，68.3%, respectively.The resistance rate to ampicillin, piperacillin, piperacillin/tazobactam and ampicillin/sulbactamare were 90.1%, 77.5%, 72.4%，67.3%, respectively.The adeB genes were detected in 33 stains out of 34 of the efflux pump phenotype positive strains, and the positive rate was 97.06%.The 33 strains were sequenced for adeB efflux pump gene.We found the sequence homology was 100.0% match with Genebank. Conclusion Active efflux pump gene inAcinetobacterbaumanniiplays an important role in multidrug resistance to beta lactam antibiotics.

Acinetobacterbaumannii; Multidrug resistance; Efflux pump；Beta lactamase

2014-05-06

2014-06-02

*河北省科技厅科技支撑计划基金资助项目(112061178D)

孙静娜(1976-)，女，河北保定人，副主任检验师，硕士，主要从事微生物学研究。电话：0311-85917323，E-mail：787164547@qq.com。

杨继章(1957-)，男，河北邢台人，主任药师，教授，硕士生导师，主要从事临床药理学研究。电话：0311-85917352，E-mail：yjzh1957@163.com。

R978.11；R965

A

1004-0781(2015)01-0040-04