京尼平对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用

张红霞

(胜利油田中心医院肾内科，东营 257034)

京尼平对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用

张红霞

(胜利油田中心医院肾内科，东营 257034)

目的 探讨京尼平对糖尿病肾病(DN)小鼠肾脏的保护作用。方法 昆明种小鼠30只，随机分为正常对照组、聚乙二醇组和京尼平组，每组10只。后两组使用链脲佐菌素腹腔注射制作小鼠DN模型。京尼平组每天给予溶解于聚乙二醇的京尼平50 mg·kg-1灌胃。聚乙二醇组只给予聚乙二醇灌胃。检测小鼠血糖、体质量、肾超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)，通过酶联免疫吸附(ELISA)检测小鼠尿清蛋白、肾肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及血清肌酐、白细胞介素-6(IL-6)的含量。采用Western blot检测小鼠肾脏核因子-κB(NF-κB)p65、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和caspase-3的表达。结果 正常对照组、聚乙二醇组和京尼平组24 h尿清蛋白分别为(11.40±0.98)，(120.30±9.57)，(56.20±4.07) mg；血清肌酐分别为(54.3±9.7)，(130.6±21.3)，(87.3±10.1) μmol·L-1；肾脏SOD活性分别为(2 430±1 010)，(2 260±370)，(3 060±400) U·L-1；肾TNF-α分别为(683.50±54.88)，(961.40±39.52)，(531.70±15.84) pg·mg-1；血清IL-6分别为(74.40±16.70)，(686.60±12.38)，(196.30±62.50) pg·mg-1。免疫印迹显示京尼平组NF-κB p65、iNOS和caspase-3的表达均降低(P<0.01)。结论 京尼平对DN小鼠肾脏具有保护作用，机制可能与其抗氧化和抗炎症作用有关。

京尼平；糖尿病肾病；氧化应激；炎症因子

中国2010年糖尿病和前驱糖尿病发病率分别为9.7%和15.5%，总人数超过2亿人[1]，其中，9%～36%的糖尿病患者最终会发展为糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)。DN是导致终末期肾病和肾移植的重要因素之一。DN患者肾小球滤过率增高，出现清蛋白尿、蛋白尿、肾小球基底膜增厚和基底膜基质出现沉积，最终造成肾小球硬化和肾小管间质纤维化，导致进行性肾功能障碍[2]。研究发现，氧化应激和炎症是导致DN发生的重要因素。高血糖可导致活性氧簇的产生增加，并同时通过对抗氧化酶的非酶糖基化降低抗氧化作用。DN患者的炎症标志物水平高于正常人群[3]。京尼平是栀子果实提取物中的活性化合物，是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，可以缓解高血糖导致的β胰岛细胞的功能障碍，增加胰岛素的分泌[4]。本研究旨在探讨京尼平是否对DN小鼠的肾脏具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 选用体质量18～22 g的无特定病原体(specefic pathogen free，SPF)级雄性昆明种小鼠30只，由山东大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鲁)2012-0014，合格证号：鲁实动字0038号，由专业人员统一进行适应性平衡饲养1周后用于实验。

1.2 试剂 链脲佐菌素(streptozocin，STZ，批号：2012S0130)购自美国Sigma-Aldrich公司，-20 ℃保存，无菌柠檬酸缓冲液购自上海前尘生物有限公司，STZ溶解于pH 4.5的无菌柠檬酸缓冲液中，现配现用。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)购于美国Sigma-Aldrich公司。尿清蛋白检测采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)定量试剂盒(美国，Bethyl Laboratories，批号：20120805)。肾组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性通过水溶性四唑盐总SOD活性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号：20120126)测定。肾组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)通过脂质氧化检测试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号：20110910)测定。肾组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及血清白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)含量采用ELISA定量试剂盒(美国eBioscience公司，批号：ZH20120902)测定。京尼平购自中国食品药品检定研究院(含量98%，批号：110850-201210)

1.3 主要仪器与环境 血糖检测应用欧姆龙血糖仪及其试纸，生化自动分析仪为德国迈瑞公司，SPF级动物饲养室。

1.4 方法

1.4.1 模型建立及分组 小鼠随机分为3组，京尼平组、PEG组和正常对照组，每组10只。前2组小鼠均腹腔注射STZ 50 mg·kg-1，连续注射5 d。DN小鼠模型制备成功标准为：①随机血糖≥16.7 mmol·L-1；②出现蛋白尿、肾功能异常。造模成功后，京尼平组每天给予溶解于PEG的京尼平(50 mg·kg-1)灌胃。PEG组只给予PEG灌胃。所有动物自由饮水。给药观察12周。

1.4.2 样本采集与检测 STZ 注射后的第12周所有动物颈动脉取血测定血糖(glucose，Glu)，分离血清测定血清肌酐(serum creatinine，SCr)，并用代谢笼收集 24 h尿液测定尿总蛋白(serum total protein，TP)、内生尿肌酐清除率( creatinine clearance rate，Ccr)。由于Ccr受体表面积的影响，本研究用Ccr/体质量(kg)加以校正。Ccr(mL·min-1·kg-1)=尿肌酐(1 μmol·L-1)×每分钟尿量(mL·min-1) /[血肌酐(μmol·L-1)×体质量(kg)]。同时取小鼠肾脏，测量肾皮质组织 SOD、 MDA、TNF-α及血清 IL-6的水平。所有处死的小鼠及生物样品灭菌后无害化处理，对不符合标准的动物和死亡的动物数量进行统计。

1.4.3 Western blot检测 在第12周，剪取小鼠肾皮质，匀浆并用含10%苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀裂解液(碧云天生物技术研究所)在4 ℃裂解细胞30 min。然后10 000×g、4 ℃离心5 min，取上清液以二辛可酸法测定蛋白浓度。取蛋白50 μg加入上样缓冲液煮沸5 min使蛋白变性。12% SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳60 min后将蛋白电转至硝酸纤维素膜上(Pall corporation，USA)。在含5%脱脂奶粉的TBST(Tris-buffered saline containing 0.05% Tween-20)缓冲液中室温封闭2 h，兔抗核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)p65多克隆IgG(1 500，Santa Cruz，USA)、兔抗诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)多克隆IgG(11 000，Chemicon，USA)、兔抗caspase-3多克隆IgG(1：250，Cell Signaling Technology，USA)以及小鼠抗β-actin单克隆IgG(1：1 000，Santa Cruz Biotechnology，USA)4 ℃孵育后过夜。TBST冲洗3次，每次8 min，然后在室温分别与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(1：5 000，Abcam，UK)或山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(1：4 000，Santa Cruz Biotechnology，USA)孵育2 h。TBST冲洗3次，用增强化学发光试剂盒(Millipore corporation，USA)曝光，图像采用AlphaView SA软件分析。目的蛋白的量以其与β-actin的比值来表示。

2 结果

2.1 DN建模结果 在第12周，正常对照组血糖正常，其余20只随机血糖≥16.7 mmol·L-1，且肾功能异常，说明DN模型成功。到实验结束时PEG组和京尼平组共死亡动物4只。

2.2 京尼平对小鼠血糖、体质量及肾功能影响 PEG组血糖显著高于正常对照组(P<0.01)，京尼平组血糖降低(P<0.05)，但仍高于正常对照组(P<0.01)。PEG组小鼠体质量较正常对照组降低(P<0.01)，京尼平组小鼠体质量较PEG组增高(P<0.05)，见表1。肾功能方面，PEG组尿清蛋白、Scr及Ccr较正常对照组均显著增高(均P<0.01)；京尼平组与PEG组相比，尿清蛋白、SCr及CCr水平明显降低(均P<0.01)。

2.3 京尼平对小鼠肾SOD活性和MDA含量影响 与正常对照组比较，PEG组小鼠肾SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；京尼平组和PEG组相比，SOD活性增加(P<0.05)，MDA降低(P<0.01)。见表1。

2.4 京尼平对小鼠肾TNF-α和血清IL-6含量影响 PEG组小鼠肾组织中TNF-α含量升高(P<0.01)，京尼平可抑制这种改变(P<0.01)。PEG组小鼠血清IL-6的含量也显著升高(P<0.01)，京尼平也可抑制这种改变(P<0.01)。见表1。

2.5 Western blot检测NF-κB p65、iNOS和促凋亡断裂caspase-3的表达 见图1。结果显示，与正常对照组比较，NF-κB p65、iNOS和caspase-3在PEG组小鼠肾组织中表达量显著升高(t=5.03，3.91，6.17，均P<0.01)，京尼平可显著降低DN小鼠肾组织中这3种蛋白的表达(t=2.72，2.69，3.05，均P<0.01)。

3 讨论

氧化应激和炎症对于DN的发生发展起重要作用。糖尿病患者SOD、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、维生素C等抗氧化因子活性或含量降低。MDA、共轭二烯(反映脂蛋白氧化情况)、晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products，AOPP)、蛋白质羰基含量和羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG)在糖尿病患者中升高。与没有血管并发症的糖尿病患者比较，DN患者的以上指标升高更加明显[5]。对于培养的足细胞，高糖可导致活性氧簇的产生，激活促凋亡p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)，进而导致足细胞的凋亡。在小鼠1型和2型糖尿病模型中，足细胞的凋亡早于足细胞的耗尽、尿清蛋白排泄和系膜基质增生，导致DN的早期病理改变[6]。

2型糖尿病和DN患者炎症标志物明显升高。IL-6可在系膜细胞和足细胞水平影响细胞外基质的变化，刺激系膜细胞的增生和纤连蛋白的表达，并增加内皮细胞的渗透性。TNF-α对于DN早期阶段出现的钠潴留和肾脏肥大具有重要作用。肾脏可以产生TNF-α，多因素分析显示尿TNF-α的水平与蛋白尿有显著关联[7]。NF-κB信号通路对DN中肾纤维化和炎症的发展起重要作用[8]。糖尿病使得活化的NF-κB转移至细胞核中并促进iNOS等靶基因的表达，进而诱导炎症的产生并导致肾小球硬化和肾小管间质的纤维化[9]。研究表明，高血糖还可通过Bcl-2、p53、caspase-3等信号通路引起足细胞、系膜细胞、近端小管上皮细胞的凋亡[10-12]。

表1 3组小鼠第12周时观察指标比较

与正常对照组比较，*1P<0.01，*4P<0.05；与PEG组比较，*2P<0.05，*3P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01，*4P<0.05；compared with PEG group ，*2P<0.05，*3P<0.01

与正常对照组比较，*1P<0.01；与PEG组比较，*2P<0.01

图1 3组小鼠肾组织中NF-κB p65、iNOS和caspase-3表达的比较

Compared with the normal group,*1P<0.01；compared with PEG group，*2P<0.01

Fig.1 Comparion of the expression of NF-κB p65，iNOS and caspase-3 in renal tissue among three groups of mice

京尼平是羟自由基清除剂，可剂量依赖地抑制亚铁离子/抗坏血酸盐诱导的大鼠脑组织的脂质过氧化反应。京尼平长时效衍生物IPRG001[(1R)-isopropy-loxygenipin]可诱导抗氧化酶HO-1(heme oxygenase-1)、NQO[NAD(P)H：quinine oxidoreductase-1]和GCLC(glutamate cysteine ligase catalytic subunit)在视网膜神经节细胞-5(retinal ganglion cells -5，RGC-5)细胞中的活性。Nrf 2(NF-E2-related factor 2)是在氧化应激情况下诱导抗氧化酶活化的关键转录因子。IPRG001在RGC-5细胞中诱导HO-1抗氧化的作用是通过Nrf 2/ARE(antioxidant response element)通路进行的[13]。缺血-再灌注可导致氧化应激反应，诱导超氧自由基、过氧化氢、羟自由基的产生增加。京尼平可减轻大鼠心脏缺血导致的自由基产生和脂质过氧化反应[14]。在炎症性疾病中，iNOS生成的一氧化氮增加并导致细胞损伤。京尼平可通过抑制NF-κB的活性来降低脂多糖/干扰素-γ诱导的鼠巨噬细胞一氧化氮的产生和iNOS的表达[15]。京尼平与氨基酸生成的食用蓝色素可以通过下调NF-κB的活性来抑制iNOS、环氧化酶-2、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达，从而抑制炎症反应[16]。京尼平可通过抑制caspase-3/7的活化和内质网应激来保护钙离子载体诱导的细胞凋亡[17]。研究显示，给予糖尿病小鼠京尼平可延缓DN的发展，减小肾小球基底膜的厚度，增加足细胞对podocin和WT1的表达。京尼平对高糖导致足细胞损伤的保护作用可能与其抑制解耦联蛋白2的上调有关[2]。

本研究显示，京尼平可降低STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖并减少体质量的降低，减少尿清蛋白的漏出，对DN小鼠肾脏具有保护作用。由于给予京尼平的DN小鼠肾脏SOD活性升高，MDA和TNF-α含量减少，NF-κB和iNOS表达减少，血清IL-6的含量减少。因此，笔者推断京尼平对DN小鼠肾脏的保护作用可能与其抗氧化和抗炎症作用有关。对京尼平或其衍生物作用机制的进一步研究可能对延缓和治疗DN具有重要意义。

[1] YANG W,LU J,WENG J,et al.Prevalence of diabetes among men and women in China [J].N Engl J Med,2010,362(12):1090-1101.

[2] QIU W,ZHOU Y,JIANG L,et al.Genipin inhibits mito-chondrial uncoupling protein 2 expression and ameliorates podocyte injury in diabetic mice [J].PLoS One,2012,7(7):1-9.

[3] SHEPLER B,NASH C,SMITH C.Update on potential drugs for the treatment of diabetic kidney disease[J].Cochrane Database Syst Rev,2012,34(6):1237-1246.

[4] ZHANG C Y,PARTON L E,YE C P,et al.Genipin inhibits UCP2-mediated proton leak and acutely reverses obesity- and high glucose-induced beta cell dysfunction in isolated pancreatic islets [J].Cell Metab,2006,3(6):417-427.

[5] PAN H Z,ZHANG L,GUO M Y,et al.The oxidative stress status in diabetes mellitus and diabetic nephropathy [J].Acta Diabetol,2010,47(Suppl 1):71-76.

[6]SUSZTAK K,RAFF A C,SCHIFFER M,et al.Glucose-induced reactive oxygen species cause apoptosis of podocytes and podocyte depletion at the onset of diabetic nephropathy [J].Diabetes,2006,55(1):225-233.

[7] NAVARRO J F,MORA C.Role of inflammation in diabetic complications [J].Nephrol Dial Transplant,2005,20(12):2601-2604.

[8] KA S M,YEH Y C,HUANG X R,et al.Kidney-targeting Smad7 gene transfer inhibits renal TGF-beta/MAD homologue(SMAD) and nuclear factor kappaB(NF-kappaB) signalling pathways,and improves diabetic nephropathy in mice [J].Diabetologia,2012,55(2):509-519.

[9] JIANG Q,LIU P,WU X,et al.Berberine attenuates lipo-polysaccharide-induced extracelluar matrix accumulation and inflammation in rat mesangial cells:involvement of NF-kappaB signaling pathway [J].Mol Cell Endocrinol,2011,331(1):34-40.

[10] GAO F,YAO M,SHI Y,et al.Notch pathway is involved in high glucose-induced apoptosis in podocytes via Bcl-2 and p53 pathways [J].J Cell Biochem,2013,114(5):1029-1038.

[11]HE D,LI J,ZHAO J,et al.C/EBP homologous protein induces mesangial cell apoptosis under hyperglycemia [J].Mol Med Report,2013,7(2):445-448.

[12] TOURIGNY A,CHARBONNEAU F,XING P,et al.CYP-24A1 exacerbated activity during diabetes contributes to kidney tubular apoptosis via caspase-3 increased expression and activation [J].PLoS One,2012,7(10):48-52.

[13]KORIYAMA Y,CHIBA K,YAMAZAKI M,et al.Long-acting genipin derivative protects retinal ganglion cells from oxidative stress modelsinvitroandinvivothrough the Nrf2/antioxidant response element signaling pathway [J].J Neurochem,2010,115(1):79-91.

[14] HOSHOVS'KA IU V,KORKACH IU P,SHYMANS'KA T V,et al.Effects of uncoupling proteins on nitric oxide synthesis and oxidative stress development in ishemia-reperfusion of old rat hearts [J].Fiziol Zh,2009,55(6):3-11.

[15] KOO H J,SONG Y S,KIM H J,et al.Antiinflammatory effects of genipin,an active principle of gardenia [J].Eur J Pharmacol,2004,495(2/3):201-208.

[16] WANG Q S,XIANG Y,CUI Y L,et al.Dietary blue pig-ments derived from genipin,attenuate inflammation by inhibiting LPS-induced iNOS and COX-2 expression via the NF-kappaB inactivation [J].PLoS One,2012,7(3):e34122.

[17]YAMAZAKI M,CHIBA K,YOSHIKAWA C.Genipin suppresses A23187-induced cytotoxicity in neuro 2a cells [J].Biol Pharm Bull,2009,32(6):1043-1046.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.006

Protective Effects of Genipin on Diabetic Nephropathy in Mice

ZHANG Hongxia

(DepartmentofKidneyMedicine,ShengliOilfieldCentralHospital,Dongying257034,China)

Objective To explore the kidney protective effects of genipin on diabetic nephropathy (DN) in mice. Methods ThirtyKunmingmice were randomly divided into normal control group, polyethylene glycol (PEG) group and genipin group (n=10).The diabetic mice model was established by intravenous injections of streptozotocin.The body weight, blood glucose concentration, kidney superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) were detected.Urinary albumin, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and serum interleukin-6 (IL-6) levels in kidney were measured by ELISA method.The expression of nuclear factor-κB( NF-κB), p65, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and caspase-3 were detected by Western blotting. Results In the normal control, PEG and genipin groups, the level of urinary albumin was (11.40±0.98)，(120.30±9.57) and (56.20±4.07) mg, respectively.Serum creatinine was (54.3±9.7) , (130.6±21.3) and (87.3±10.1) μmol·L-1, repectively .The renal SOD activity was (2 430±1 010), (2 260±370), and (3 060 ± 400) U·L-1, respectively.The renal TNF-α level was (683.50±54.88) , (961.40±39.52) and (531.70±15.84) pg·mg-1, respectively.Serum IL-6 level was (74.40±16.70) , (686.60±12.38) and (196.30±62.50) pg·mg-1, repectively.The expression of NF-κBp65, iNOS and caspase-3 in the kidney of genipin group were all decreased(P<0.01). Conclusion Genipin protects kidneys in DN mice through antioxidation and anti-inflammation effects.

Genipin; Diabetic nephropathy; Oxidative stress; Inflammation factor

2013-11-18

2014-05-21

张红霞(1975-)，女，山东东营人，副主任医师，硕士，研究方向：肾脏病学。电话：(0)13864780209，E-mail：zhanghxdy@163.com。

R282.71；R285.5

A

1004-0781(2015)01-0026-05