脉血康胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠MMP-2和TIMP-2表达的影响*

郭庆喜，蒲霞，陈凯锋，曹灵，杨成万，孙兴旺

(1.泸州医学院病理教研室，泸州 646000；2.解放军第42医院病理科，乐山 614100；3泸州医学院附属医院肾病内科，泸州 646000)

·药物研究·

脉血康胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠MMP-2和TIMP-2表达的影响*

郭庆喜1，蒲霞1，陈凯锋2，曹灵3，杨成万1，孙兴旺1

(1.泸州医学院病理教研室，泸州 646000；2.解放军第42医院病理科，乐山 614100；3泸州医学院附属医院肾病内科，泸州 646000)

目的 观察脉血康胶囊对大鼠单侧输尿管梗阻性肾(UUO)组织中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)表达的影响，探讨脉血康胶囊对肾间质纤维化的影响及其作用机制。方法 SD雄性大鼠96只，随机分为正常对照组、假手术组、模型对照组及脉血康组，各24只。前3组给予0.9%氯化钠溶液灌胃，脉血康组于手术前3 d开始给予脉血康胶囊0.05 g·kg-1·d-1，以0.9%氯化钠溶液2 mL稀释灌胃，于造模后第1，4，7，14天每组随机处死6只大鼠，观察肾组织内MMP-2及TIMP-2表达。结果 模型对照组及脉血康组的MMP-2表达从第4天起逐渐减少，且脉血康组MMP-2表达高于模型对照组。TIMP-2的表达在模型对照组及脉血康组明显增多，且脉血康组TIMP-2表达低于模型对照组。模型对照组及脉血康组MMP-2/TIMP-2较正常对照组及假手术组显著降低；第14天，模型对照组和脉血康组MMP-2/TIMP-2分别为0.595±0.138，0.892±0.158，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 脉血康胶囊可能通过上调MMP-2及下调TIMP-2来调节肾脏细胞外基质的代谢而抑制UUO大鼠肾间质纤维化。

脉血康胶囊；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶组织抑制因子；肾间质纤维化

肾间质纤维化是各种慢性肾病进展到终末期的主要病理改变之一。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肾间质中过度沉积是肾间质纤维化的主要特征。ECM主要由肾间质肌纤维母细胞(myofibroblast，MFB)合成[1]，基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinases，MMPs)及金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metaloproteinases，TIMPs)的活性异常与ECM沉积密切相关。临床研究发现脉血康胶囊对慢性肾衰竭等具有较好的疗效。笔者应用脉血康胶囊治疗单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠，动态观察早期梗阻性肾病MMP-2及TIMP-2表达情况，探讨脉血康胶囊对肾间质纤维化作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 普通级雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，生产许可证号：SCXK(川)2008-1-7，使用许可证号：SYXK(川)2008-065，由泸州医学院实验动物中心提供。动物饲养环境为每笼1只，室温(22±2) ℃。脉血康胶囊购于重庆时珍阁普生药业有限公司(批准文号：国药准字Z10970056)。兔抗鼠MMP-2多克隆抗体、TIMP-2多克隆抗体购于北京博奥森生物公司，免疫组化即用型SP试剂盒购于福州迈新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠UUO模型的制备及药物处理 普通级雄性SD大鼠96只，周龄6～7周，体质量(180±20) g，随机分为4组，正常对照组、假手术组、模型对照组、脉血康组，各24只。大鼠用2%戊巴比妥溶液50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，手术区局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择下腹正中线切口，经皮切开逐层进入腹腔，寻找膀胱，然后在膀胱颈处分离出右侧输尿管，4号丝线2次结扎右侧输尿管入膀胱段，然后逐层缝合关腹，制作大鼠UUO模型[2]。脉血康组和模型对照组均按上述步骤进行手术。假手术组手术入路方式同上，但不结扎输尿管。正常对照组不进行手术。脉血康组手术前3 d及手术后给予脉血康胶囊0.05 g·kg-1·d-1(预实验显示该剂量效果较好)，以0.9%氯化钠溶液2 mL稀释灌胃；正常对照组、假手术组及模型对照组均给予同体积0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.2.2 标本采集 各组分别于第1，第4，第7，第14天按随机编号选取大鼠6只，各用2%戊巴比妥溶液0.5 mL腹腔注射麻醉后，暴露心脏及双侧肾脏，用50 mL注射器抽吸4%甲醛溶液40 mL，从大鼠心脏加压注入，对大鼠组织进行固定，小心分离出大鼠双侧肾脏，于肾门处剪断肾蒂，对剖，置于盛有4%多聚甲醛的玻璃瓶中固定，待做病理及免疫组化检测。

1.2.3 免疫组化及结果评定 大鼠肾脏经固定、脱水、包埋制成组织蜡块，石蜡切片机切片，免疫组织化学染色采用strept avidin-biotin complex(SABC)法，染色步骤按MMP-2及TIMP-2试剂盒说明书进行。均设阳性对照及阴性对照。结果判定及半定量分析：采用真彩色病理图像分析系统，通过显微镜摄取图像，对图像自动测量。每张切片随机观察不重叠的视野20个，计算阳性表达部位染色总面积与视野内肾小管间质总面积(去除肾血管、肾小球及肾小管管腔面积)，以两者比值的平均值进行比较[3]。

2 结果

2.1 大鼠MMP-2动态表达 MMP-2主要在肾小管上皮细胞质中表达，呈棕黄色颗粒状。脉血康组与正常对照组及假手术组比较，MMP-2表达减少，从第4天起差异有统计学意义(t=2.26,P<0.05)；与模型对照组比较，MMP-2表达略增加，第14天显著增加(P<0.05)。(表1，图1，2)。

2.2 大鼠TIMP-2动态表达 TIMP-2主要表达于肾小管上皮细胞细胞质，呈棕黄色颗粒状。脉血康组随梗阻时间延长TIMP-2表达逐渐增加，第7天起显著增加(P<0.01)，各时间点表达较正常对照组及假手术组显著增加(P<0.01)，较模型对照组表达降低，第7天起差异有统计学意义(P<0.05)(图3，4，表2)。

2.3 MMP-2/TIMP-2结果 脉血康组MMP-2/TIMP-2逐渐下降，从第7天起差异有统计学意义(P<0.01)，与正常对照组及假手术组比较，各时间点均显著降低(P<0.01)，与模型对照组比较，MMP-2/TIMP-2均升高，第14天差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表1 4组大鼠肾小管上皮细胞MMP-2的动态表达

Tab.1 Dynamic expression of MMP-2 in renal tubule epithelial cell in four groups of rats

与正常对照组及假手术组相同时间点比较，*1P<0.05；与模型对照组相同时间点比较，*2P<0.05

Compared with the normal control group and the sham operation group at the same time point，*1P<0.05；compared with the model control group at the same time point，*2P<0.05

Fig.1 MMP-2 expression in model control group(SABC×400)

Fig.3 TIMP-2 expression in model control group(SABC×400)

Fig.2 MMP-2 expression inmaixuekanggroup(SABC×400)

Fig.4 TIMP-2 expression inmaixuekanggroup(SABC×400)

表2 4组大鼠肾小管上皮细胞TIMP-2的动态表达

Tab.2 Dynamic expression of TIMP-2 in renal tubule epithelial cell in four groups of rats

与正常对照组及假手术组相同时间点比较，t=11.427～40.335，*1P<0.01；与模型对照组相同时间点比较，t=3.929，5.811，*2P<0.05

Compared with normal control group and sham operation group at the same time point，t=11.427-40.335，*1P<0.01；compared with model control group at the same time point，t=3.929，5.811，*2P<0.05

表3 4组大鼠肾小管上皮细胞MMP-2/TIMP-2比较

Tab.3 Comparison of MMP-2/TIMP-2 in renal tubule epithelial cell in four groups of rats

与正常对照组及假手术组相同时间点比较，*1P<0.01；与本组第1天比较，*2P<0.05；与模型对照组相同时间点比较，t=3.476，*3P<0.01

Compared with normol control group and sham operation group at the same time point，*1P<0.01；compared with itself at the first day，*2P<0.05；compared with model control group at the same time point，t=3.476，*3P<0.01

3 讨论

肾间质纤维化是由各种原发性或继发性肾脏疾病导致的进行性肾单位破坏、间质成纤维细胞增生及ECM沉积的病理过程。研究发现，肾间质纤维化的发生、发展与ECM的过度沉积和ECM降解受到抑制密切相关[4]。因此，调控ECM代谢的因子在肾间质纤维化的发生、发展中起着重要作用。MMPs及其抑制剂(TIMPs)是重要的ECM调控系统，是肾脏内主要的基质降解体系。MMPs家族是一组依赖二价金属阳离子的内肽酶，几乎能降解除多糖以外的全部ECM成分。MMP-2是肾脏表达的主要MMPs家族成员，可降解多种ECM成分，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原及纤维连接蛋白等。研究发现，MMP-2基因敲除小鼠肾间质纤维化进程更快，程度更重[5]，MMP-2在肾间质纤维化进程中发挥着重要作用，是最主要的调控因子之一。TIMPs是一组内源性分泌蛋白，是MMPs的天然抑制物，可与MMPs酶原相结合阻止其活化，也可与活化的MMPs结合而抑制MMPs。生理状态下，MMPs与其抑制物TIMPs保持相对平衡，使有活性的MMPs控制在一定范围内。在病理状态下，MMPs表达减少或活性下降，TIMPs表达增高，MMPs和TIMPs平衡破坏，即可导致ECM 的沉积。TIMP-2是TIMPs家族成员。笔者在本实验观察到随着梗阻时间延长，MMP-2表达减低，TIMP-2表达升高，MMP-2/TIMP-2逐渐降低，促进ECM沉积，导致肾间质纤维化。YANG等[6]实验证实在膀胱出口部分梗阻的患者中存在MMPs/TIMPs平衡破坏。也有研究证实肾组织内MMPs/TIMPs平衡破坏，尤其是TIMP-2的增多，使ECM降解减少，可促进肾间质纤维化形成[7]。上述结果均与本实验结果一致。

临床应用脉血康胶囊治疗慢性肾衰竭患者具有一定的疗效，但作用机制不清，本研究通过预实验选定最佳剂量脉血康溶液灌胃治疗UUO大鼠，研究脉血康胶囊抑制肾间质纤维化的可能作用途径。脉血康胶囊主要成分是水蛭素，水蛭素是从动物药水蛭中提取的一种酸性多肽类物质，具有抗凝与抗血栓形成、降低血压和血脂、改善血流动力学和微循环等作用[8]。研究发现，脉血康胶囊可通过抑制血小板聚集，改善肾脏血液流变学，降血脂，消退动脉粥样硬化斑块和减少蛋白尿等途径对肾脏起到保护作用[9]。还可能发挥抑制炎症递质凝血酶的效应，抑制甲基纤维素增生和抗ECM蓄积，从而达到对抗慢性肾病肾小球硬化的作用[10]。但有关脉血康胶囊对UUO肾脏保护作用的研究还鲜见报道。本实验结果显示，脉血康胶囊可通过增加MMP-2表达，抑制TIMP-2表达，促进ECM的降解，从而延缓肾间质纤维化。由此推测，脉血康胶囊能够通过影响肾脏基质金属蛋白酶系统，减少ECM的沉积，延缓肾间质纤维化的进程。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.001

Dynamic Observation ofMaixuekangCapsule on the Expression of MMP-2 and TIMP-2 in Rats with Unilateral Ureteral Obstruction

GUO Qingxi1, PU Xia1, CHEN Kaifeng2, CAO Ling3, YANG Chengwan1, SUN Xingwang1

(1.DepartmentofPathology,LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China; 2.DepartmentofPathology,thePeople’sLiberationArmy42Hospital,Leshan614100,China; 3.DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitaltoLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Objective To study the effect ofmaixuekangcaspsule on the expression of matrix metalloproteinases-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metaloproteinases-2 (TIMP-2) in the occlusion kidney dynamically by unilateral ureteral obstruction (UUO) in rats, and to investigate the effect and the mechanism ofmaixuekangcaspsule on the renal interstitial fibrosis (RIF). Methods The model rats were induced by ligating the right ureter.Ninety-six male Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into normal control group, sham-surgery group, model control group andmaixuekanggroup (0.05 g·kg-1·d-1by gastric gavage started 3 days prior to operation).Rats were sacrificed on the 1th, 4th, 7th and 14th day after UUO was initiated.The immunohistochemical technique and image analysis technique were performed to examine the expression of MMP-2 and TIMP-2 in each group. Results On day 4 after UUO, the expression of MMP-2 decreased in both model control andmaixuekanggroups, but the expression was significantly higher inmaixuekanggroup compared with the model control group (P<0.05).The expression of TIMP-2 was raised in both model control andmaixuekanggroups, but the expression was significantly lower inmaixuekanggroup compared with the model control group (P<0.05).On day 14 after UUO, the MMP-2/TIMP-2 ratio decreased in both model control andmaixuekanggroups, but the ratio inmaixuekanggroup (0.892±0.158) was significantly higher than the model control group (0.595±0.138,P<0.05). ConclusionMaixuekangcaspsule regulates the metabolism of extracellular matrix to postpone the proceeding of RIF, by eliciting the expression of MMP-2 and down-regulating the expression of TIMP-2.

Maixuekangcaspsule; Matrix metalloproteinases; Tissue inhibitors of metaloproteinases; Renal interstitial fibrosis

2013-12-06

2014-03-01

*四川省科技厅重点项目(2010JY0080)；泸州市科技局项目[泸市科(2004)60]

郭庆喜(1977-)，男，四川眉山人，讲师，硕士，研究方向：肾脏病理学和分子病理学。电话：0830-3161808 ，E-mail：gqx_77@163.com 。

孙兴旺(1965-)，男，陕西临潼人，教授，学士，研究方向：肾脏病理和分子病理。电话：0830-3161808，E-mail：lzsunxw@163.com。

R286；R285.5

A

1004-0781(2015)01-0003-04