重组肝CYP3A4与CYP3A29细胞微粒体药物代谢动力学比较

薛正楷，魏泓

(1.泸州职业技术学院生物与医学工程研究所，泸州 646005；2.第三军医大学实验动物中心，重庆 400038)

重组肝CYP3A4与CYP3A29细胞微粒体药物代谢动力学比较

薛正楷1，2，魏泓2

(1.泸州职业技术学院生物与医学工程研究所，泸州 646005；2.第三军医大学实验动物中心，重庆 400038)

目的 比较巴马小型猪CYP3A29和人CYP3A4稳定表达重组肝癌细胞株微粒体的药物代谢特征，在分子水平为巴马小型猪作为临床前药物代谢实验动物提供科学依据。方法 以CYP3A特异性代谢底物硝苯地平、睾酮及其抑制药酮康唑为探针药物，将探针药物与重组CYP3A4、CYP3A29细胞微粒体在优化的微粒体浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育，高效液相色谱法检测其药物代谢(抑制)动力学参数，并将二者进行比较分析。结果 巴马小型猪CYP3A29与CYP3A4在硝苯地平和睾酮代谢差异无统计学意义(P>0.05)。酮康唑的抑制活性为：当代谢底物为硝苯地平时，酮康唑对CYP3A29和CYP3A4的半数抑制浓度分别为0.090，0.132 μmol·L-1(P<0.05)；当代谢底物为睾酮时，酮康唑对CYP3A29和CYP3A4的半数抑制浓度分别为0.056，0.032 μmol·L-1(P<0.05)。结论 重组CYP3A29与CYP3A4细胞微粒体对硝苯地平和睾酮活性差异不显著；酮康唑对重组CYP3A29与CYP3A4细胞微粒体硝苯地平和睾酮代谢活性有差异。

重组细胞；微粒体；CYP3A4；CYP3A29；药物代谢动力学

在临床前药物代谢ADMET(吸收，Absorption，A；分布，Distribution，D；代谢，Metabolism，M；排泄，Excretion，E；毒性，Toxicity，T)研究中，啮齿类动物犬、猴是传统的实验动物，与小型猪相比，其饲养成本较高，且价格昂贵；同时，小型猪被用于比较医学研究已有相当长的历史，其解剖学、生理学和生物化学特征与人极为相似，因而受到生物医学界的重视。此外，犬和猴由于动物保护和伦理学方面的原因，其在生物医学研究中的应用越来越受到严格限制[1-2]。因此，近年在药物代谢实验中，用小型猪越来越广泛地替代犬和猴作为非啮齿类动物的ADMET实验模型[3-4]。小型猪CYP3A亚家族酶共有4种亚型：CYP3A22、CYP3A29、CYP3A39和CYP3A46(CYP3A88)(http：//drnelson.utmem.edu/pig.CYPs.htm)。利用CYP3A特异性底物进行的活体动物实验表明，小型猪的CYP3A具有典型的硝苯地平氧化活性(人体CYP3A4 和CYP3A5的特异活性)，且能被苯巴比妥、利福平和地塞米松诱导[5-7]。已有的小型猪肝组织实时定量聚合酶链反应及其肝组织微粒体实验显示，CYP3A29是小型猪(猪)体内与人CYP3A4/5同源性最高的CYP3As，且代谢活性与CYP3A4极为相似[8-10]。但与此不同的是，SHANG等[11]以实时-聚合酶链反应检测CYP3AmRNA在巴马小型猪各组织的相对表达量，发现CYP3A22在肝组织中表达量最高，而CYP3A46肝外组织表达量最高，CYP3A29在十二指肠的表达量最高，其他组织相对表达量均较低，据此，SHANG等推测CYP3A22和CYP3A46可能是巴马小型猪体内重要的功能酶，但缺乏对CYP3A29的分子代谢动力学研究。

笔者曾对CYP3A29基因异源表达及其表达活性进行了初步分析，但未对其药物代谢动力学进行进一步的研究[12]。因此，本研究旨在利用本实验室筛选成功的稳定表达的人HepG2-CYP3A4和巴马小型猪HepG2-CYP3A29，以硝苯地平、睾酮和酮康唑为探针药物，在微粒体水平比较CYP3A4和巴马小型猪YP3A29的代谢动力学特征，为巴马小型猪作为人CYP3A药物代谢临床前实验动物提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 HepG2、HepG2-pcDNA3.1由中国人民解放军复合伤研究所王艾平博士惠赠；HepG2-CYP3A4、HepG2-CYP3A22由薛正楷博士构建并保存[12]。

1.2 试剂 达尔伯克必需基本培养液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)、G418购自Gibco公司；硝苯地平、氧化硝苯地平、睾酮、6β-羟基睾酮(6β-hydroxyl-testosterone，6β-OHT)、葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G-6-P) 、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-P-DH)、辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)、牛血清清蛋白、酮康唑和二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均购自Sigma公司；Trypan blue溶液(0.4%)、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)为Amresco公司产品；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、考马斯亮蓝G-250购自碧云天生物技术研究所；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.3 仪器与设备 酶标仪：bio-rad 680型全自动酶标仪，Bio-rad公司。细胞分析计数仪：型号 Z2，BECKMAN公司。血细胞计数板：型号XB-K-25，上海安信光学仪器制造有限公司。色谱柱：Hypersil ODS C18(4.6mm×150 mm，5 μm)；色谱柱：Phenomenex C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。

1.4 实验方法

1.4.1 色谱条件

1.4.1.1 检测硝苯地平代谢的色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇：水(64：36，V/V)；柱温40 ℃；流速0.5 mL·min-1；检测波长：237 nm；进样量50 μL。

1.4.1.2 检测睾酮代谢的色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱温40 ℃；流动相：甲醇：水(52：48，V/V)；洗脱梯度：0～15 min线性梯度为48%→30%水，～20 min，30%→20%水；流速1.0 mL·min-1；紫外检测波长245 nm；进样量50 μL。

1.4.2 微粒体的制备 按常规细胞培养方法[13]培养重组细胞；胰酶消化贴壁的HepG2-CYP3A4和HepG2-CYP3A29细胞，1 500 r·min-1(r=15 cm)离心4 min，立即放入0～4 ℃冰浴中，用0.15 mol·L-1氯化钾溶液冲洗干净并称质量，每克重组细胞与氯化钾(200.15 mol·L-1)-磷酸盐缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 7.4)3 mL混合，用匀浆器制成细胞匀浆。4 ℃、9 000×g离心20 min，吸取上清液，然后4 ℃、100 000×g离心60 min，弃去上清液，所得粉红色沉淀即为肝微粒体。将粉红色的肝微粒体取出，悬浮于体积分数为30%甘油-氯化钾-磷酸盐缓冲液中，分装后将制备好的肝微粒体置于-85 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.4.3 Bradford法测微粒体蛋白质含量 采用考马斯亮蓝染色法，将待测大鼠肝微粒体样本稀释50倍后，于波长595 nm处，以空白管调零，测吸光度，计算蛋白浓度，其他操作按试剂盒使用说明进行。

1.4.4 微粒体孵育和样品处理 在96孔板中建立微粒体体外反应体系，该体系包括：100 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH7.4)，10 mmol·L-1G-6-P，1 mol·L-1NADP，4 mmol·L-1氯化镁溶液，1 U·mL-1G-6-P脱氢酶，终体积为200 μL。按照优化的微粒体浓度(0.5 mg·mL-1)，底物浓度(硝苯地平为50 μmol·L-1，睾酮为100 μmol·L-1)，37 ℃预孵3 min，反应体系通过加入NADP起始反应，反应按优化的时间(硝苯地平10 min、睾酮12 min)，用36%高氯酸溶液20 μL终止反应并沉淀蛋白，4 ℃条件下，转速10 000 r·min-1(r=10 cm)，离心10 min，取上清液50 μL用于高效液相色谱(HPLC)检测。

1.4.5 数据分析 数据统计和比较采用Excel 和SPSS17.0版软件，曲线的拟合采用Excel和Sigmaplot；量效关系曲线及酶动力学参数采用Sigmaplot软件中的Hill方程(V=Vmax[S]n/(S50+[S]n))拟合。相对活性的计算：以对照组CYP3A的活性为100%，实验组CYP3A的活性比对照组，即为相对活性；半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)的计算方法：参考杨树勤[14]提供的半数效量概率单位法进行，即：根据实验组抑制剂对底物抑制剂浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算值IC50。

2 结果

2.1 重组CYP3A4/29微粒体蛋白测定结果 重组细胞微粒体HepG2-pcDNA3.1、HepG2-CYP3A4和HepG2-CYP3A29总蛋白浓度分别为(1 987.00±214.38)，(1 856.00±105.43)，(1 982.00±222.13) mg·mL-1。对3种重组细胞株微粒体蛋白浓度采用SPSS软件包中One-Way ANOVA模块进行多因素方差分析，结果表明，3种重组细胞株微粒体蛋白浓度差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 重组CYP3A4/29微粒体硝苯地平代谢HPLC方法考察 见图1。结果表明，微粒体孵育液中内源性

物质不干扰硝苯地平的测定，硝苯地平的保留时间为10.58 min，氧化硝苯地平的保留时间为8.16 min。

A.空白微粒体；B.失活微粒体+硝苯地平；C.失活微粒体+硝苯地平+氧化硝苯地平；1.硝苯地平；2.氧化硝苯地平

图1 3种微粒体的HPLC色谱图

A.blank microsomes；B.inactive microsomes spiked with nifedipine；C.inactive microsomes spiked with nifedipine and oxidation of nifedipine；1.nifedipine；2.oxidation of nifedipine

Fig.1 HPLC chromatograms of three kinds of microsomes

2.3 硝苯地平代谢的酶动力学参数 采用米氏方程拟合得到的酶动力学参数[最大酶促反应速率(Vmax)、内在清除率(Clint)、米氏常数(Km)]。见表1。

采用SPSS软件包中成对数据T检验模块对表1中重组细胞HepG2-CYP3A29和HepG2-CYP3A4微粒体硝苯地平代谢的动力学参数Vmax、Km、Clint进行比较，结果表明，两种微粒体对硝苯地平的代谢动力学参数均差异无统计学意义(均P>0.05)，表明CYP3A29与CYP3A4的硝苯地平代谢活性相似。

表1 重组细胞微粒体对硝苯地平代谢的动力学参数

Tab.1 Metabolic kinetic parameters of nifedipine in recombinant microsomes

2.4 酮康唑对重组CYP3A4/29微粒体的抑制作用 见表2。从表2可见，在0.00～10.00 μmol·L-1范围内，酮康唑对重组CYP3A4和CYP3A29的抑制作用具有浓度依赖关系，随着酮康唑浓度的增大，酮康唑对硝苯地平的抑制作用逐渐增强，酮康唑对HepG2-CYP3A29微粒体的抑制作用显著强于对HepG2-CYP3A4微粒体(P<0.05)。

2.5 酮康唑对重组CYP3A4/29微粒体抑制作用的概率回归方程 见图2。根据回归方程，求得CYP3A4和CYP3A29的IC50分别为：0.132和0.090 μmol·L-1，酮康唑对二者的IC50均<1 μmol·L-1，因此，酮康唑是二者的强抑制剂，并且酮康唑对CYP3A29的抑制活性强于CYP3A4。

2.6 睾酮代谢的色谱方法学考察 见图3。在本实验设定的色谱条件下，比较各组色谱结果，孵育液中内源性物质不干扰睾酮和6β-OHT标准品色谱结果，说明本色谱方法对睾酮和6β-OHT的测定具有专属性，睾酮的保留时间为17.05 min，6β-OHT的保留时间为10.61 min。

2.7 睾酮代谢的酶动力学参数 见表3。采用SPSS软件包中成对数据t检验对3种动力学参数Vmax、S50、Clint进行比较，动力学参数均差异无统计学意义(P>0.05)，表明两种重组细胞微粒体对睾酮代谢无明显差异。

2.8 酮康唑对重组细胞睾酮代谢的抑制作用 见表4。从表4可知，酮康唑对重组细胞微粒体的睾酮代谢具有浓度依赖性，随着酮康唑浓度的增加，抑制作用增强，酮康唑对HepG2-CYP3A4微粒体睾酮代谢的抑制作用比HepG2-CYP3A29显著增强(P<0.05)。

2.9 酮康唑对重组细胞的抑制作用的回归方程 见图4。根据回归方程，求得CYP3A4和CYP3A29的IC50分别为0.032和0.056 μmol·L-1。酮康唑对二者的IC50均<1 μmol·L-1，因此，酮康唑是二者睾酮代谢的强抑制剂，其对CYP3A4抑制作用强于CYP3A29。

3 讨论

动力学参数是决定酶促反应特征曲线的决定因素，包括有米氏常数Km、Vmax和Clint，其中Km表示理论上酶促反应速率达到最大速率一半时所需的底物浓度，反映了酶与底物的亲和能力，其值越小亲和能力越强，是药物酶促反应的特征参数；Vmax是在底物浓度等外界条件完全满足时某种反应可能达到的速率最大效能，可反映药物酶促反应的内在效应特征；Clint的体外相关性可由每一代谢途径的Vmax/Km比值表示，用以说明或比较特定代谢途径对药物清除的相对贡献，在药物代谢特征从体外实验向体内实验转变中起重要作用，是酶对底物代谢效率的直接量度。

表2 在不同浓度酮康唑作用下的重组CYP3A微粒体相对活性

A.blank microsomes；B.inactive microsomes spiked with 6β-OHT；C.inactive microsomes spiked with testosterone and 6β-OHT；1.6β-OHT；2.testosterone

Fig.3 HPLC chromatograms of three kinds of microsomes

表3 重组细胞微粒体对睾酮代谢的动力学参数

Tab.3 Metabolic kinetic parameters of testosterone in recombinant micrsomes

表4 在不同浓度酮康唑作用下重组细胞微粒体对睾酮代谢的相对活性

Tab.4 Relative activity of recombinant microsomes on testosterone metabolism treated by different concentrations of ketoconazole

Fig.4 Probability regression equation of the inhibition on testosterone metabolism in recombinant CYP3A4/29 microsomes by different concentrations of ketoconazole

在HepG2-CYP3As微粒体催化硝苯地平的代谢中，由于CYP3A29的Km与CYP3A4几乎无差异，而前者的Vmax与后者相当，说明HepG2-CYP3A29微粒体对硝苯地平氧化反应的总体反应活性与HepG2-CYP3A4差异不显著；比较人CYP3A4与小型猪CYP3A29体外微粒体孵育的硝苯地平代谢的Clint、Km和Vmax的结果相似，即HepG2-CYP3A4微粒体的硝苯地平代谢活性与HepG2-CYP3A29差异无统计学意义。

将本实验体外微粒体孵育实验获得硝苯地平代谢的Vmax结果与文献[15-16]数据比较，结果为猴肝微粒体>Guinea猪肝微粒体>本实验>巴马小型猪≌贵州小型猪>人>鼠>犬，表明在临床前药物的大型动物实验中，巴马小型猪比目前通用的实验模型动物犬更优。

CYP3A4催化睾酮代谢的作用机制表明，CYP3A4具有大的底物结合“口袋”，可同时结合3个睾酮分子，第1个睾酮分子的结合增加了CYP3A4对还原型辅酶Ⅱ的氧化率，虽然无羟基化产物的形成，所有的还原当量分流到解耦联途径；第2个睾酮分子的结合，对睾酮分子的氧化最为重要，此时，睾酮羟基化产物形成率达到最大值；第3个睾酮分子的结合虽然并不提高睾酮的代谢产物形成率，但提高了CYP3A4对还原当量的利用效率，因此CYP3A4对睾酮的羟基化代谢具有非典型的米氏酶动力学特征，适合于Hill方程描述的代谢动力学[17-19]。

本研究结果表明，重组细胞微粒体CYP3A4和CYP3A29的Hill系数均>1，说明二者对睾酮的代谢均属于正协同作用[20-21]。由于Vmax反映酶对底物代谢的活性，CYP3A29Vmax比CYP3A4略低，说明CYP3A29对睾酮羟基化活性比CYP3A4低，但差异无统计学意义；S50近似反映酶对底物的亲和力，本实验重组的CYP3A4和CYP29的S50相近，二者对睾酮的亲和力关系为：CYP3A4与CYP3A29差异不显著；Clint是酶对底物代谢效率的直接量度，分析本实验重组的两种CYP3A微粒清除率Clint，发现其关系与Vmax和S50反映的酶特征基本一致；酮康唑对人CYP3A4和巴马小型猪CYP3A29重组细胞微粒体的睾酮代谢的IC50结果表明，酮康唑对CYP3A29的抑制作用低于CYP3A4。

将本实验获得CYP3A酶动力学参数与文献比较发现，其CYP3A29的Vmax、S50和Clint与文献[22]的人肝微粒体睾酮代谢特征最接近，说明本实验结果具有较高的参考性。

总之，本实验通过重组细胞微粒体体外孵育探针底物硝苯地平和睾酮及抑制药酮康唑，获得的重组人CYP3A4和小型猪CYP3A29体外微粒体孵育酶代谢特征表明，巴马小型猪HepG2-CYP3A29与HepG2-CYP3A4微粒体在硝苯地平和睾酮代谢有差异，但差异无统计学意义。酮康唑的抑制作用为：对CYP3A29的硝苯地平代谢抑制作用强于CYP3A4，对CYP3A4睾酮代谢的抑制作用强于CYP3A29。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.004

Comparison of Pharmacokinetics Between Recombinant Liver Microsomes with CYP3A4 and CYP3A29

XUE Zhengkai1,2, WEI Hong2

(1.InstituteofBiomedicalEngineering,LuzhouVocationalandTechnicalCollege,Luzhou646005,China; 2.LaboratoryAnimalCenter,CollegeofBasicMedicalScience,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To compare the pharmacokinetic characteristics of microsomes from the recombinant cell lines of HepG2 with CYP3A4 and CYP3A29 in Bama miniature pigs, and provide evidence for clinical animal testing. Methods The probe drugs nifedipine (NF), testosterone (TST) and ketoconazole (KCZ) were incubated with the recombinant microsomes of HepG2-CYP3A4 and HepG2-CYP3A29 under optimal conditions of concentration and duration.The high performance liquid chromatograph (HPLC) was utilized to detect the metabolites, and characteristics of the two types of microsomes were compared. Results There was no significant difference in the metabolic activities between CYP3A29 and CYP3A4 for both nifedipine and testosterone (P>0.05).The half inhibitory concentrations of ketoconazole for CYP3A29 and CYP3A4 were 0.090 and 0.132 μmol·L-1(P<0.05), respectively, using nifedipine as the metabolism substrate, and were 0.056 and 0.032 μmol·L-1(P<0.05), respectively, using testosterone as metabolism substrate. Conclusion There is no significant difference between cell microsomes with CYP3A29 and CYP3A4 in metabolizing nifedipine and testosterone, but ketoconazole has significantly different inhibitory activity towards the two types of microsomes.

Recombinant cell lines; Microsomes; CYP3A4; CYP3A29; Pharmacokinetics

2013-07-09

2014-01-08

薛正楷(1968-)，男，重庆人，副教授，博士，研究方向：分子代谢与工程，电话：(0)13909087693，E-mail：zk.xue988@163.com。

R969.1

A

1004-0781(2015)01-0015-07