葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠空间工作记忆和5-羟色胺的影响*

刘文倩，赵雅宁，李建民

(河北联合大学康复医学院，唐山 063000)

葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠空间工作记忆和5-羟色胺的影响*

刘文倩，赵雅宁，李建民

(河北联合大学康复医学院，唐山 063000)

目的 探讨葡萄籽原花青素(GSPE)对慢性间歇性大鼠空间工作记忆和5-羟色胺(5-HT)的影响。方法 健康雄性SD大鼠80只，随机分为正常对照组、模型对照组、GSPE小剂量组(100 mg·kg-1)和GSPE大剂量组(200 mg·kg-1)，每组20只。正常对照组暴露于空气中，模型对照组和GSPE小、大剂量组暴露于低氧(50 mL·L-1)条件下，暴露时间每天8 h，持续6周；Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆能力；应用苏木精-伊红染色观察脑组织形态变化；用高效液相色谱法测定大脑皮质内5-HT的含量。结果 与正常对照组比较，模型对照组水迷宫测试结果显示大鼠潜伏期明显延长，穿台次数明显减少；皮质区存活神经细胞数量减少，5-HT含量明显降低(P<0.05)。与模型对照组比较，GSPE小、大剂量组水迷宫检测大鼠逃避潜伏期时间缩短、穿台次数增多，皮质区存活神经细胞数量增多，5-HT含量明显增多(P<0.05)；上述变化在GSPE大剂量组更为显著(P<0.05)。结论 GSPE可增加5-HT含量，改善间歇性低氧大鼠空间工作记忆能力。

葡萄籽原花青素；低氧，间歇性；5-羟色胺；记忆

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS) 可造成患者记忆障碍，并出现执行能力和运动协调方面的认知问题[1-2]。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是脑内重要的神经递质，与许多功能调节有关，如睡眠、性行为、情感行为以及学习和记忆等[3]。原花青素是天然植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，以葡萄籽中含量最为丰富。研究表明，葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)具有抗氧化、清除自由基、心血管保护、降血脂、抗肿瘤等功能[4-5]，但目前有关GSPE对睡眠呼吸暂停及工作记忆影响研究少见报道。笔者采用浓度结合时间切换的方式模拟临床睡眠呼吸暂停状态的低氧，建立慢性间歇性低氧模型，探讨GSPE对间歇性低氧大鼠空间记忆与5-HT的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 清洁级雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠80只(中国医学科学院实验动物研究所动物资源中心提供，生产许可证号：中科动管第003号，动物使用合格证号：0127011)，体质量210～230 g，饲养于河北联合大学动物实验中心，实验室环境：温度22～26 ℃，相对湿度40%～70%；测氧仪(建德市梅城电化分析仪器厂)；低氧控制程序(河北联合大学医院呼吸科)；纯氮(唐山六方气体高科技有限公司)；低氧舱(天津医科大学研制)。GSPE由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供(纯度95%，批号：20060705)。

1.2 动物分组与模型制备 雄性SD大鼠80只，采用抽签法随机分成正常对照组、模型对照组，GSPE大、小剂量组，各组动物20只。正常对照组：向舱内循环注入压缩空气30 s，流速3 L·min-1；空气90 s流速3 L·min-1，氧浓度维持在21%；模型对照组：模拟临床呼吸暂停事件，每天8：00～16：00将实验动物置于模型舱内，向舱内循环充入氮气30 s，流速为10 L·min-1，空气40 s，流速为10 L·min-1(复氧时间)，空气50 s流速为5 L·min-1(常氧维持时间)，每2 min为1个循环，使得舱内氧浓度在5%～21%间循环[6]，每天实验8 h，持续时间为6周。干预组在动物进入低氧模型舱前2周开始每天灌胃给药1次，持续给药6周，GSPE大、小剂量分别为200，100 mg·kg-1。用数字测氧仪监测舱内氧浓度变化，使舱内氧浓度维持在各自的氧浓度内，使其氧浓度波动范围在±0.5%以内。

模型对照组抽签法随机取大鼠2只，分别在连续12个低氧暴露周期内不同时间点采血。以刚开始充入氮气作为零时间采血点，实验分析第一个时间点应该是大鼠体内血氧分压开始下降点。依次在下一个周期内采血，每个采血点都较前一个采血周期点推后10 s，一个周期内2 min，正好为12个采血时间点，采取的动脉血在10 min内送至血气分析室测定，记录大鼠动脉血气氧分压、二氧化碳分压之间的变化情况，以判断模型是否成功。

1.3 记忆功能检测 采用Morris水迷宫检测。实验时，将安全岛置于水迷宫第二象限中，加水至高过安全岛2～3 cm，水温保持在22～25 ℃，由摄像机及计算机自动跟踪、摄相和统计大鼠分别由四个象限入水后寻找到安全岛的轨迹、潜伏值和穿台次数。如在90 s内未找到安全岛，则潜伏期值记为90 s。在规定时间点处死前晨起训练5次后，分别在上午、下午各测试3次，共6次纳入统计，记录各组大鼠逃避潜伏期时间及撤去平台后穿越原平台位置的次数，取总均值。

1.4 脑组织形态结构观察及病理组织学检测 动物用4%多聚甲醛灌注固定后取脑，截取视交叉平面至大脑横裂脑组织，常规石蜡包埋。Leica石蜡切片机连续冠状切片，片厚5 μm，苏木精-伊红染色。在有测微尺的光学显微镜(200倍)下观察额叶皮质区神经细胞形态变化并计数该视野下的存活神经细胞数量(有明显细胞膜、细胞核、核仁为存活神经细胞)。具体方法：将每个标本取4张切片，在额叶皮质区随机选取视野4个，在有测微尺的光学显微镜(200倍)下观察额叶皮质区阳性细胞变化并计数，以每个视野下平均细胞百分率(皮质区存活细胞数量与总细胞数量比值/%)表示。

1.5 高效液相色谱(HPLC)法检测脑内5-HT HPLC Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保护柱DIKMA(4 mm×8 mm，5 μm)。柱温20 ℃，流动相选用柠檬酸、柠檬酸三钠、甲醇-离子对试剂-依地酸二钠混合液(pH4.2)，经孔径0.22 μm的滤膜过滤后使用，梯度洗脱：0～5 min 97.5%A；～12 min 97.5%→88.0%A；12～16 min 85.0%A；～30 min 85.0%A；～35 min 85.0%→97.5% A。流速1.0 mL·min-1。检测器设定电压为350 mV。取冻存大鼠脑皮层准确称质量，用预冷的高氯酸(内含0.15 μg·mL-12，3-二羟基甲酸)制备10%的组织匀浆，离心15 min，上清液经孔径0.22 μm的滤膜过滤后取10 μL自动进样，在上述色谱条件下，采用内标法测定5-HT含量，以ng·g-1脑组织湿质量表示，样本处理液：0.01%半胱氨酸加0.2 mol·L-1高氯酸钠加0.5 mmol·L-1依地酸。标准液配制：0.1 mol·L-1制备成0.35 mg·mL-1对照品储存液，按上述色谱条件下处理。

2 结果

2.1 GSPE对慢性间歇性低氧大鼠空间记忆能力的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠逃避潜伏期时间均延长，穿越原平台位置的次数均减少；与模型对照组比较，GSPE组大鼠逃避潜伏期时间显著缩短，穿越原平台位置的次数明显增加(P<0.05)。见图1和表1。

与正常对照组同时间点比较，*1P<0.05；与模型对照组同时间点比较，*2P<0.05；与GSPE小剂量组同时间点比较，*3P<0.05

Compared with normal control group at the same time point，*1P<0.05；compared with model control group at the same time point，*2P<0.05；compared with low-dose GSPE group at the same time point，*3P<0.05

2.2 GSPE对慢性间歇性低氧大鼠皮质区神经细胞形态结构的影响 正常对照组大鼠大脑皮层结构完整，细胞排列整齐。模型对照组大鼠在间歇性低氧2，6周均可见变性坏死神经细胞，胞体收缩呈三角形，细胞质嗜色性减弱，核皱缩浓染，细胞周围出现空隙；视野内可见核溶解及神经细胞空泡样变，细胞间隙显著增宽，存活神经细胞均明显减少(P<0.05)；GSPE组中皮质区神经细胞结构损伤减轻，大部分细胞结构完整，存活神经细胞显著增多(P<0.05)，见图2。

2.3 GSPE对慢性间歇性低氧脑组织5-HT含量的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠脑皮质中5-HT含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，GSPE组中脑组织5-HT含量都有不同程度升高(P<0.05)。见表2。

3 讨论

工作记忆包括负责加工位置、距离等空间信息的视空间模板和处理语音方面的信息语音环路以及中央执行系统，其核心系统位于前额叶[7]。神经影像学显示OSAHS患者大脑的多个部位和功能区受损如大脑皮质灰质丢失、含海马区在内的脑实质萎缩等；应用事件相关电位评测睡眠呼吸暂停患者，发现反映信息加工的事件电位N270电位(前额及枕部)波幅降低，患者工作记忆降低[8]。笔者在本研究利用水迷宫评测动物记忆行为，其中逃避潜伏期反映大鼠寻找平台位置的能力，即有效获取及有效处理信息的能力；穿越原平台位置次数反映记忆的保持能力。结果显示GSPE可改善OSAHS低氧导致的工作记忆损伤。研究认为OSAHS造成的间歇性低氧类似于缺血-再灌注，可造成脑内生成大量氧自由基，导致神经细胞结构损伤、丢失，引起记忆功能损害[9]；而GSPE抗氧化能力极强，是维生素E的50倍、维生素C的20倍，与超氧化物歧化酶相当[10]，因此可改善睡眠呼吸暂停大鼠记忆能力，能增强其信息的获取、加工及保持能力。

表2 4组大鼠皮质区存活神经细胞密度和5-HT含量比较

Tab.2 Comparison of the density of viable nerve cell and 5-HT content in cortex among four groups of rats

与正常对照组同时间点比较，*1P<0.05；与模型对照组同时间点比较，*2P<0.05；与GSPE小剂量组同时间点比较，*3P<0.05

Compared with normal control group at the same time point，*1P<0.05；compared with model control group at the same time point，*2P<0.05；compared with low-dose GSPE group at the same time point，*3P<0.05

5-HT是脑内存在的一种重要的神经递质，对记忆的调节以及脑功能的维持有重要作用。MAZER等[11]给成年大鼠脑中灌注酪氨酸羟化酶抑制剂对氯苯丙氨酸以耗竭5-HT，结果出现大鼠学习能力缺损。学习记忆能力下降的大鼠其脑内5-HT亦显著降低[12]。研究发现迷迭香对血管性痴呆大鼠学习记忆功能有改善作用，且这种作用与脑内5-HT的改变有关[13]。睡眠呼吸暂停患者体内5-HT水平发生变化，且这种变化与病情的严重程度相关[14]。本研究结果显示，随间歇性低氧时间的延长，大鼠脑内5-HT的含量降低，说明5-HT参与OSAHS模式间歇性低氧对中枢神经系统的病理进程。睡眠OSAHS模式的间歇低氧造成的反复低氧后再复氧，可引起神经细胞能量代谢障碍、氧自由基损伤，导致单胺类神经递质5-HT等合成、摄取和释放紊乱，脑实质神经细胞内5-HT含量降低[15]。本研究中，给予GSPE干预后，模型大鼠脑内5-HT含量明显改善，其表达水平呈剂量依赖性显著增加，说明GSPE对睡眠呼吸暂停间歇性低氧大鼠脑内5-HT水平有一定调节作用。这可能是GSPE改善OSAHS致工作记忆损伤的机制之一。

总之，本实验结果表明，GSPE可调节OSAHS模式低氧大鼠脑内5-HT水平，减轻睡眠OSAHS模式低氧大鼠空间工作记忆能力。鉴于GSPE具有多种药理活性，其改善OSAHS神经损伤及调控5-HT的机制有待进一步探讨。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.003

Effects of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Spatial Working Memory and 5-Hydroxytryptamine in the Rat Model of Intermittent Hypoxia

LIU Wenqian,ZHAO Yaning,LI Jianmin

(NursingandRehabilitationCollegeofHebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effects of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) on 5-hydroxytryptamine (5-HT) and spatial working memory after intermittent hypoxia in rats. Methods Eighty male Sprague Dawley (SD) rats were divided randomly into four groups (n=20 in each group)：the normal control, model control, GSPEs at small (100 mg·kg-1) and high (200 mg·kg-1) dose groups.Rats in the normal control group were exposed in air and the model controls suffered from intermittent hypoxia (50 mL·L-1, 8 hours daily for 6 weeks).The spatial memory ability of rats in each group was assessed with the Morris water maze (MWM).The morphological changes of neuronal cell were observed by HE staining.The concentration of 5-HT in brain was detected by high performance liquid chromatography. Results Compared with the normal control group, the MWM test showed that the latency was prolonged and the frequency of crossing the platform was higher than that in model control group (P<0.05).The survival cells and the concentration of 5-HT significantly decreased in the model control group (P<0.05).Compared with the model control group, MWM test showed that the escaping latency was shortened and the frequency of crossing the platform was increased in the GSPE treatment groups compared with the model control group (P<0.05).The above observations are more significant in GSPE high dose group that the low dose group.The survival cells and the concentration of 5-HT significantly increased in the GSPE treatment groups (P<0.05). Conclusion GSPE can regulate the concentration of 5-HT and improve learning memory function under intermittent hypoxia.

Grape seed proanthocyanidin extract; Hypoxia, intermittent; 5-Hydroxytryptamine; Memory

2013-12-11

2014-05-31

*河北省教育厅重点资助项目(ZH2012046)

刘文倩(1988-)，女，河北唐山人，硕士，从事神经外科工作。电话：0315-3726234，E-mail：liuwenqian1988@126.com。

李建民(1974-)，女，河北唐山人，教授，博士，从事脑损伤与脑保护研究工作。电话：0315-3726234，E-mail：zyning789@126.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)01-0011-05