右美托咪定对脓毒症肺损伤大鼠的保护作用

杨鹏，侯俊，徐青果，陈春，汤和青，柯齐斌

(三峡大学第一临床医学院麻醉科，宜昌 443003)

右美托咪定对脓毒症肺损伤大鼠的保护作用

杨鹏，侯俊，徐青果，陈春，汤和青，柯齐斌

(三峡大学第一临床医学院麻醉科，宜昌 443003)

目的 探讨右美托咪定(Dex)对脓毒症肺损伤大鼠的保护作用及其机制。方法 雄性SD大鼠100只，随机分为4组，每组25只。Ⅰ组为假手术组，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症模型。Ⅱ组为模型对照组；Ⅲ组分别于CLP手术后0，2，4，6 h腹腔注射Dex 12.5 μg·kg-1；Ⅳ组分别于CLP手术后0，2，4，6 h腹腔注射Dex 25.0 μg·kg-1。CLP手术后0，2，4，6，24 h分别测定肺组织肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6浓度，CLP后24 h酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定肺组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平，Western blot测定肺组织Toll样受体4(TLR4)表达，检测肺组织湿/干质量比(W/D)，苏木精-伊红染色观察肺组织的病理变化。结果 与Ⅱ组比较，Ⅲ组和Ⅳ组中肺组织TNF-α、IL-6及HMGB1水平明显降低(P<0.05)，肺组织TLR4表达及W/D明显降低，病理学损伤也明显减轻(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ组之间差异无统计学意义。结论 Dex抑制炎症反应从而减轻脓毒症大鼠的肺损伤，其机制可能通过抑制TLR4通路来实现。

右美托咪定；脓毒症；损伤，肺；炎症反应

脓毒症是由感染或可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，病情凶险，死亡率高。肺组织是脓毒症过程中最易受损的器官之一，其超强的炎症反应被视为主要的病理生理改变[1]。研究证实Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)介导脓毒症导致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)[2-3]。高迁移率族蛋白B1(high-modility group box 1，HMGB1)在脓毒症和失血性休克中和ALI的发生率密切相关，能通过相关途径来激活TLR4[4]。针对HMGB1的靶向调控是近年来治疗感染性和损伤性炎症反应的新策略[5]。α2肾上腺素受体激动药右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)可以降低全身炎症反应从而延长生存时间[6-7]。然而Dex调节炎症反应的具体作用机制尚不明确。笔者通过建立大鼠脓毒症模型，探讨Dex对脓毒症肺损伤大鼠的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)无特定病原体(specefic pathogen free，SPF)级大鼠100只，体质量250～300 g，由武汉大学医学院动物实验中心提供[合格证号：SCXK(鄂)2008-0004]，使用许可证号：SCXK(鄂)2010-2012。饲养环境：温度21～25 ℃，湿度50%～60%。

1.2 试剂 大鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(日本IBL，批号：27194)，白细胞介素(interleukin，IL)-6和HMGB1试剂盒(海博谷生物科技有限公司，批号分别为REI020和REH002)，Western blot测定肺组织TLR4(北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-1021R)。Dex注射液(江苏恒瑞医药股份公司，批号：12081024)。

1.3 模型制备与分组 大鼠实验前禁食12 h，自由饮水，采用随机数字表法分为4组(n=25)：Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组。本实验采用经典的盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture，CLP)建立大鼠脓毒症模型[8]。大鼠给予10%水合氯醛3.5×10-3mL·g-1腹腔注射麻醉，备皮消毒。于腹正中切开1 cm切口，1号丝线结扎1/2盲肠，以20G针头在游离端对穿1次后送回腹腔，之后分离缝合肌层及皮肤，以浸润0.9%氯化钠溶液的纱布覆盖切口处，减少切口处体液蒸发。Ⅰ组仅行开腹不行盲肠结扎穿孔，其他组行GLP建模，大鼠活动减少，嗜睡，出现呼吸困难，表明造模成功。Ⅲ、Ⅳ组于CLP后0，2，4，6 h分别腹腔注射Dex 12.5，25.0 μg·kg-1。Ⅰ、Ⅱ组于相同时间点注射等体积0.9%氯化钠溶液。分别于CLP后0，2，4，6，24 h处死各亚组动物并取标本，每个亚组标本5份。CLP后24 h取出右肺后拭干表面血液，用天平称其质量即为湿质量，放入80 ℃烤箱烘烤48 h后，再次称其质量，即为干质量。计算湿干质量比例(W/D)。左肺上端储存-80 ℃液氮中行Western blot测定肺组织TLR4表达，下肺组织行苏木精-伊红染色观察肺组织的病理变化。肺损伤的病理评估方法参照OZDULGER等[9]的研究，1 分：无损伤，正常肺组织结构；2 分：轻度损伤，轻度的肺间质充血和中性粒细胞浸润；3分：中度损伤，血管周围水肿形成，肺组织结构部分破坏并伴中度的中性粒细胞浸润；4 分：严重损伤，肺组织结构严重破坏，大量中性粒细胞浸润。各时间点取肺组织于4 ℃匀浆，离心15 min后取上清液于-80 ℃保存，ELISA法测定肺组织TNF-α、IL-6浓度和HMGB1水平。

2 结果

2.1 肺组织TNF-α和IL-6浓度比较 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肺组织TNF-α和IL-6浓度在CLP后逐渐升高。Ⅲ、Ⅳ组TNF-α浓度在CLP 2，4及24 h较Ⅱ组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ组IL-6浓度在CLP 2，4，6，24 h均较Ⅱ组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，2。

2.2 TLR4表达比较 Ⅱ组TLR4蛋白表达较Ⅰ组显著升高，经Dex干预后，Ⅲ、Ⅳ组TLR4蛋白表达较Ⅱ组明显降低。见图1。

表1 4组大鼠肺组织TNF-α浓度比较

Tab.1 Comparison of TNF-α level in lung tissue among four groups of rats

与Ⅰ组比较，*1P<0.01；与Ⅱ组比较，*2P<0.05

Compared with group Ⅰ，*1P<0.01；compared with group Ⅱ，*2P<0.05

表2 4组大鼠肺组织IL-6浓度比较

Tab.2 Comparison of IL-6 level in lung tissue among four groups of rats

与Ⅰ组比较，*1P<0.01；与Ⅱ组比较，*2P<0.05

Compared with group Ⅰ，*1P<0.01；compared with group Ⅱ，*2P<0.05

Fig.1 TLR4 expression in lung tissue of four groups of rats

2.3 CLP 24 h各组肺组织HMGB1浓度、 W/D和肺组织损伤评分比较 CLP 24 hⅢ、Ⅳ组肺组织HMGB1浓度、 W/D和肺组织损伤评分较Ⅱ组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组之间差异无统计学意义。见表3。显微镜下见Ⅱ组肺间质细胞增多，肺泡腔缩窄，大量炎性细胞聚集。Ⅲ、Ⅳ组肺泡腔完整，炎性细胞少。见图2。

表3 4组大鼠肺组织HMGB1、W/D和肺损伤评分比较

与Ⅰ组比较，*1P<0.05；与Ⅱ组比较，*2P<0.05

Compared with group Ⅰ，*1P<0.05；compared with group Ⅱ，*2P<0.05

3 讨论

强大的炎症反应被视为脓毒症重要的病理生理过程[10]。脓毒症的动物模型目前有两种：脂多糖诱导和CLP。笔者采用CLP建模后，大鼠活动减少，嗜睡，出现呼吸困难，证实造模成功。Dex作为高选择性α2肾上腺素能受体激动药，可减少脓毒症时单核巨噬细胞产生的细胞因子TNF-α和IL-6，在脓毒症时产生器官保护作用[11-12]。TANIGUCHI等[13]实验证实Dex可抑制动物脓毒症休克的炎症反应并降低死亡率，其效应具有剂量和时间相关性。LAI等[14]观察到大剂量Dex(约10倍临床剂量)可明显抑制脓毒症大鼠巨噬细胞炎症因子和细胞分子表达的上调。Dex分布半衰期为6 min，清除半衰期为2 h，故选择12.5和25.0 μg·kg-1两个剂量多个时间点进行后处理，发现Dex两个剂量均能显著降低TNF-α和IL-6的表达，明显减轻肺组织损伤，产生效应无明显差异。

脓毒症导致的ALI，包括产生大量促炎症因子和炎症细胞浸润，这些都是导致死亡的重要因素。因此减轻炎症反应是降低脓毒症死亡率的重要方法。TNF-α和IL-6是炎症中重要的启动因子，是导致肺损伤最早释放的细胞因子。HMGB1是一种重要的晚期炎症因子，含有3个结构域：两个同源的DNA结合结构域(A框和B框)与C末端。其中B框是HMGB1诱导细胞因子的部分，刺激中性粒细胞和单核巨噬细胞分泌TNF-α等致炎症细胞因子[15]。细胞一旦受损伤，膜结构遭受破坏，HMGB1会以单纯扩散的方式释放HMGB1，触发炎症反应。凋亡或坏死细胞被动释放HMGB1，启动早期炎症应答，及时清除异物对损伤组织或器官起到修复作用；单核巨噬细胞等免疫细胞以及神经元主动分泌HMGB1，作为促炎症细胞因子样物质，启动晚期炎症应答。在趋化因子的作用下，使更多的炎症细胞浸润到受损的组织，病理损伤进一步加重。DENG等[2]研究表明HMGB1激活巨噬细胞产生炎症细胞因子导致ALI。TLR4是TLR家族中跨细胞膜受体蛋白的重要成员之一，主要在内皮细胞以及包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等免疫细胞的表面表达，在脂多糖信号识别中起重要作用。TLR4能够通过髓样分化蛋白88来介导核因子-κB的激活，增加TNF-α和IL-6生成。HMGB1受体主要分为两大类，一类是晚期糖化终产物受体，另一类是TLR。HMGB1主要与TLR2、TLR4两种受体结合，结合后通过活化髓样分化蛋白88、IL-1受体相关激酶以及肿瘤坏死因子受体活化因子-6，最终导致核因子-κB的活化和转录进核，生成和释放促炎细胞因子，激发一系列炎症反应[16]。本研究表明，Dex下调CLP后的HMGB1的表达，下调的HMGB1减少TNF-α和IL-6生成；TLR4表达下调同样减少炎症细胞因子的生成，同时下调HMGB1和TLR4结合，进一步减少促炎症因子，减轻肺组织的损伤。本研究仅局限于CLP后24 h，在今后研究中需对脓毒症整个过程跟踪观测。

总之，Dex可抑制炎症反应从而减轻脓毒症大鼠的肺损伤，其机制可能通过抑制TLR4通路来实现。

[1] FULLER B M，MOHR N M，DETTMER M，et al.Mechanial ventilation and acute lung injury in emergency department patients with severe sepsis and septic shock：an observation study[J].Acad Emerg Med，2013，20(7)：659-669.

[2] DENG Y，YANG Z，GAO Y，et al.Toll-like receptor 4 medi-tates acute lung injury induced by high mobility group Box-1[J].PloS One，2013，8(5)：e64375.

[3] TAUSEEF M，KNEZEVIC N，CHAVA K R，et al.TLR4 ac-tivation of TRPC6-dependent calcium signaling mediates endotoxin-induced lung vascular permeability and inflammation[J].Exp Med，2012，209(11)：1953-1968.

[4] KAWAI T，AKIRA S.The role of pattern-recognition recep-tors in innate immunity：update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol，2010，11(5)：373-384.

[5] ZHU S，LI W，WARD M F，et al.High mobility group box 1 protein as a potential drug target for infection- and injury-elicited inflammation[J].Inflamm Allergy Drug Targets，2010，9(1)：60-72.

[6] HOFER S，STEPPAN J，WAGNER T，et al.Central symp-tholytics prolong survival in experimental sepsis[J].Crit Care，2009，3：R11.

[7] QIAO H，SANDERS R D，MA D，et al.Sedation improves early outcome in severely septic Sprague Dawley rats[J].Crit Care，2009，13(4)：136-140.

[8] SINGLETON K D，WISCHMEYER P E.Distance of cecum ligated influences mortality，tumor necrosis factor -alpha and interleukin -6 expression following cecal ligation and puncture in the rat[J].Eur Surg Res，2003，35(6) ：486-491.

[9] OZDULGER A，CINEL I，KOKSEL O，et al.The protective effect ofN-acetylecysteine on apoptotic lung injury in CLP-induced sepsis model[J].Shock，2003，19(4)：366-372.

[10] DELONG P，MURRAY J A，COOK C K.Mechanial venti-lation in the management of acute respiratory distress syndrome [J].Semi Dialysis，2006，17(10)：517-524.

[11] MEMIS D，HEKIMOGLU S，VATAN I，et al.Effects of mi-dazolam and dexmedetomidine on inflammatory responses and gastric intramucosal pH to sepsis in critically ill patients[J].Br J Anaesth，2007，98(4)：550-552.

[12] KAWASAKI T，KAWASAKI C，UEKI M，et al.Dexmede-tomidine suppresses proinflammatory mediator production in human whole bloodinvitro[J].Trauma Acute Surg，2013，74(5)：1370-1375.

[13] TANIGUCHI T，KURITA A，KOBAYASHI K，at al.Dose-and time-related effects of dexmedetomidine on mortality and inflammatory responses to endotoxin-induced shock in rats[J].J Anesth，2008，22(3)：221-228.

[14] LAI Y C，TSAI P S，HUANG C J.Effects of dexmedeto-midine on regulating endotoxin-induced up-regulation of inflammatory molecules in murine macrophages[J].Surg Res，2009，154(1)：212-219.

[15] THOMAS J O.HMGB 1 and 2 ：architectural DNA-binding proteins[J].Biochem Soc Trans，2001，29(4)：395-401.

[16] YANG Q W，WANG J Z，LI J C，et al.High-mobility group protein box-1 and its relevance to cerebral ischemia[J].Cereb Blood Flow Metab，2010，30(2)：243-254.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.005

Protective Effect of Dexmedetomidine on Acute Lung Injury Induced Sepsis in Rats

YANG Peng,HOU Jun,XU Qingguo,CHEN Chun,TANG Heqing,KE Qibin

(DepartmentofAnesthesiology,theFirstCollegeofClinicalMedicalScience,ThreeGorgesUniversity,Yichang443003,China)

Objective To investigate the protective effect of dexmedetomidine (Dex) on septic lung injury in rats. Methods One hundred male SD rats were randomly divided into four groups (n=25 in each group).Group Ⅰ was treated with sham operation only.Groups Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ

cecal ligation and puncture (CLP) to create the sepsis model.Group Ⅱ served as model control, group Ⅲ and Ⅳ received intraperitoneal injections of Dex at 12.5 and 25.0 μg·kg-1, respectively, at 0,2,4,and 6 hours after CLP.TNF-α and IL-6 in lung tissue were measured at 0,2,4,6, and 24 h.ELISA was used to detect the levels of HMGB1, TNF-α and IL-6 at 24 h.The expression of TLR4 protein was assessed by western blotting.The acute lung injury was detected by HE stain and W/D ratio. Results In groups Ⅲ and Ⅳ, the expressions of TNF-α and IL-6 were decreased significantly compared with group Ⅱ(P<0.05).The expression of TLR4 in lung tissue and W/D ratio were decreased in groups Ⅲ and Ⅳ compared with group Ⅱ(P<0.05).There was no significant difference between group Ⅲ and Ⅳ. Conclusion Dexmedetomidine can attenuate lung inflammatory reaction and lung injury in septic rats, the mechanism of which may be related to suppression of TLR4 pathway.

Dexmedetomidine; Septic; Injury, lung; Inflammatory reaction

2013-09-06

2014-03-06

杨鹏(1982-)，男，湖北荆州人，主治医师，硕士，研究方向：临床麻醉和器官保护。电话：(0)15997516957，E-mail：88452338@qq.com。

侯俊(1969-)，男，湖北荆州人，副主任医师，学士，研究方向：小儿麻醉和器官保护。电话：(0)15871598615，E-mail：houjun691218@126.com。

R971.2；R965

A

1004-0781(2015)01-0022-04