化学药物杂质研究进展

岳悦，骆雪芳，钟文英，侯雯

（1.中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009；2.南京卡文迪许生物工程技术有限公司，江苏 南京 210033）

化学药物杂质研究进展

岳悦1,2，骆雪芳1，钟文英1*，侯雯2

（1.中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009；2.南京卡文迪许生物工程技术有限公司，江苏 南京 210033）

药物杂质的分析和控制是用药安全有效的基础。从杂质谱分析、杂质检测、杂质限度的制定等方面综述了近年来国内外化学药物杂质研究进展，旨在为化学药物杂质的研究提供有效思路和方法。

杂质谱；杂质检测；杂质限度；有关物质；手性杂质；遗传毒性杂质

药物研发过程中，杂质的控制是药品质量研究的关键问题。任何影响药物纯度的物质被称为杂质。“杂质谱”是药物杂质控制的眼睛，能够“看见”所有杂质。与药物杂质控制的前2个阶段“纯度控制”和“限度控制”相比，杂质谱的质控策略是根据药物中的每一个杂质的活性逐一制定质量控制限度，因此更加严格规范[1]。化学药物杂质检测方面，有关物质、手性杂质和遗传毒性杂质的分析是药物杂质研究中关注的重点。随着杂质安全性评价和风险控制的要求越来越高，杂质限度的合理制定也是一项重要研究内容。近5年来国内针对化学药物杂质的研究综述仅有2篇[1-2]，其中1篇侧重于有色杂质和生化药品杂质分析[2]。本文结合2015年版《中国药典》和相关指导原则，依据化学药物杂质研究思路，从杂质谱分析、杂质检测、杂质限度的制定3个方面，综述了近年来国内外化学药物杂质的研究进展。

1 杂质谱分析

杂质谱分析主要包括2个方面。其一，依据药物结构、理化性质，分析药物合成工艺、制剂工艺中可能产生的杂质。欧洲药品管理局（EMA）建议“应基于扎实的科学评价，全面考虑参与合成的化学反应、原辅料中可能带入新原料药的杂质和可能的降解产物，确定最有可能在新药的合成、纯化和贮存期间出现的实际和潜在杂质”[3]。其二，考察药物稳定性试验和强制降解试验产生的杂质。药物质量标准中杂质检查项目应包含经研究和稳定性考察检出的杂质，2015年版《化学药物稳定性研究技术指导原则》明确了不同保存温度下的拟加速和长期稳定性试验方法，并在有效期的基础上提出了复检期。参照《中国药典》和《化学药物稳定性研究技术指导原则》，研究可能的降解产物和降解途径。Sajan等[4]对卡维地洛进行强制降解试验研究发现，药物在氧化破坏的条件下会形成杂质卡维羟胺。依泽替米贝在高温、酸、碱、水解、氧化条件下会产生主要降解产物依泽替米贝四氢吡喃杂质[5]。强制降解试验提供了原料的降解途径，也能够为制剂处方和工艺的筛选提供一定的依据。通过稳定性试验和强制降解试验可以进一步分析杂质的来源和影响因素，为杂质的质量控制提供参考。

2 杂质检测

2.1 一般杂质的检测

气相色谱法（GC）适用于易挥发且热稳定性的物质，一般用于残留溶剂的检测[6]。无机杂质可能来源于原料药、辅料或制剂的生产过程和环境污染物中。2015年版《中国药典》加强了包括催化剂在内的无机杂质检测方法的研究与修订，提高了方法的准确性。因在药物生产中经常会遇到铅，且铅易积蓄中毒，故药物质量控制中经常以铅作为重金属的代表，用其限量表示重金属限度。经典的重金属限度检查法存在一定的局限性，已在2010年版《中国药典》（一部）收录，且在2015年版《中国药典》第二、三部新增的电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[7]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）可以同时定量检测多种金属元素的含量[8]。不同化学形态的金属杂质在毒理学和生物学上的性质可能有很大差异，HPLC-ICP-MS法对分析极低含量、不同形态的As和Hg有着灵敏度高、易于操作的优势。

2.2 特殊杂质的检测

2.2.1 有关物质在杂质谱分析的基础上，有针对性地选择专属灵敏的分析方法，以确保化学药物杂质的有效检出。在有关物质检查方面，2015年版《中国药典》加强了对化学药物杂质定性定量测定方法的研究，增加了正文所涉及的448个杂质的结构式等分子信息，实现对已知杂质和未知杂质的区别控制，进一步提高有关物质测定项目的科学性和合理性[9]。杂质检测的方法学验证主要包括专属性、检测限、溶液稳定性、耐用性等定性试验以及线性、准确度、精密度等定量试验，从不同角度、层面验证分析方法的可行性和杂质检出的可靠性[10]。

近年来，色谱法在各国药典中得到了广泛应用[11]，其中有关物质分析方法的主流还属高效液相色谱技术[12]。Wang等[13]采用HPLC法定量测定艾普拉唑片有关物质，并进行方法学验证。HPLC测定有关物质的定量方法主要有杂质对照品法(外标法)、加校正因子和不加校正因子的主成分自身对照法以及面积归一化法。朱静毅等[14]建立了HPLC加校正因子的主成分自身对照法测定非洛地平及其片剂中3个有关物质的含量，其校正因子分别为1.96、0.96和1.06，方法学验证表明所建立的方法符合要求，加校正因子的主成分自身对照法与杂质对照品法测定的结果无显著性差异。

其他新型色谱分析方法如超高效液相色谱UPLC也具有其独特的优势。UPLC在《美国药典》中已得到应用[15]，2015年版《中国药典》中虽未将其作为新液相色谱方法收载，但也积极推动了UPLC在药品质量标准制定中的应用。研究者采用UPLC法定量测定马拉韦罗有关物质，在BEH Shield RP-18（100 mm× 2.1 mm, 1.7 μm）色谱柱上进行分离，流速0.4 mL·min-1，结果在12 min内马拉韦罗与6个杂质达到基线分离，分离度均大于3.0[16]。与HPLC相比，UPLC流速低，流动相用量少，具有更高的分离度和更快的分析速度。由于紫外检测灵敏度低而无法实现对低浓度杂质的准确定量，Yamamoto等[17]采用新型二维高效液相色谱（2D-HPLC）技术增强对样品的分离和富集，提高对低浓度杂质的检测能力。为获得杂质纯度高的单一杂质进行检测，利用制备型液相色谱技术可以克服分析型液相色谱杂质制备困难、耗时的问题，加快高纯度杂质的获取。Liu等[18]用制备型HPLC分离得到普拉雷格的一个新工艺杂质，对其进行结构鉴定推导出该杂质可能的形成过程。

目前，色谱联用技术在药物杂质检测方面有很大的发展潜力。人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）明确规定：每日最大剂量不超过2 g的原料药中含量大于0.1%的有关物质须鉴定其结构[19]。将色谱法与具有定性能力的光谱法相结合，不仅具有较高灵敏度和选择性，还能够给出丰富的结构信息，提高其结构鉴定能力。

液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术因其卓越的灵敏度、高选择性和快速的特点，避免了样品复杂的前处理过程，已成为药物中微量杂质分析和结构鉴定的首选。主要分为高分辨率质谱(HRMS)、多级质谱(MSn)、氢/氘转换质谱(HDE-MS) 3 类。Yuan等[20]首次采用LC-MS法对硫酸依替米星进行有关物质分析，结果检测出26个杂质，其中14个杂质是新检测出的杂质，根据质谱信息和合成途径进行结构分析发现，起始原料、中间体、副产物和降解产物是这些有关物质的主要来源。Kalariya等[21]采用熔融核Fused-Core C18(100 mm × 2.1 mm, 2.6 μm) 色谱柱快速高效地分离甲磺酸依普罗沙坦的6个杂质，经LC-MS进行结构分析。Shivakumar等[22]采用四极杆-飞行时间串联液质联用（LC/Q-TOF）技术对环磷酰胺强制降解产物进行定性定量分析。该法提高了杂质鉴定的效率，是有关物质检查和结构鉴定的有力工具之一。

气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术结合了气相色谱高效与质谱结构鉴定的优势，适用于定性、定量分析热稳定、易挥发的多组分混合物中有机挥发性杂质。研究者采用GC-MS检测抗组胺药茶苯海明（DMH）的6个有关物质；样品无需衍生化，经三氟丙基甲基聚硅氧烷（Rtx-200）毛细管气相色谱柱分离，GC-MS检测；各有关物质在不到15 min内实现良好分离。该方法已成功应用于DMH片剂的质量研究，回收率大于96.80%[23]。Belal等[24]采用GC-MS 法测定抗心肌缺血药盐酸曲美他嗪（TMZ）的2个有关物质，并应用于市售TMZ药物制剂的杂质检测。

核磁共振（NMR）技术能够对未知化合物提供有关键合和立体化学的特定信息，并对未经分离提取的复杂样品提供定性定量信息。与LC联用，更加强了NMR对有关物质的结构解析能力，应用于药品质量评估[25]。高效液相色谱-固相微萃取-核磁共振联用（LC/SPE/NMR）仪是目前应用最先进LC-NMR技术的仪器[26]，借助SPE，为NMR在较低强度磁场的应用打开了新局面。Narayanam等[27]采用LC-NMR技术鉴定出西拉普利水解杂质的结构，其氧化降解杂质最终则通过制备型HPLC分离，并采用一维核磁（1H、13C、DEPT）和二维核磁（COSY、TOCSY、HETCOR和HMBC）法确证了结构。

毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）技术将CE绿色环保、分析成本低、所需样品量少、样品前处理简单的优点与MS高灵敏度、高专属性和定性归属能力相结合，在极性和离子化合物的分析方面有着独特优势，成为LC-MS和 GC-MS的重要补充。Klepárn í k等[28]详细综述了CE-MS的各种方法和应用，其中药物杂质分析是重要应用方面。Taichrib等[29]采用毛细管电泳-四极杆飞行时间串联质谱（CE/Q-TOF）技术检测替可克肽中的杂质，通过精确的质量和碎片离子信息确证了其中3个杂质的结构。

2.2.2 手性杂质手性杂质与药物互为手性异构体，两者药效和药动学行为的差异会导致不同的药理和毒理学作用，产生药物不良反应。因此手性杂质的检测也是质量控制的重要内容。对于手性杂质的检测广泛采用手性色谱法和高效毛细管电泳法等[30]。

手性高效液相色谱法分为直接法和间接法，前者包括手性固定相法和手性流动相添加剂法，后者为手性试剂衍生化法。Sharp等[31]筛选了纤维素型、大环抗生素型和刷型手性柱分离新型心血管药物evacetrapib及其对映体、非对映体及6个潜在杂质，最终采用刷型Whelk-O 1手性柱进行HPLC分离，异构体杂质首先出峰。该方法有效解决了在一个较短的分析时间内所有化合物被洗脱分离，可应用于evacetrapib原料药对映体的检测。Babu等[32]在分离阿格列汀中间体R-3-氨基哌啶（R-AMP）中的S-异构体时，由于AMP没有紫外生色团，需要先对化合物进行柱前衍生化，然后在手性Chiralpak AD-H色谱柱上进行HPLC分离，两对映体之间的分离度大于4.0。

CE和CE-MS法分离效率高、简便快速、低消耗、分离模式多，在手性杂质分离中具有很多优势。Qi等[33]采用CE法研究左旋氨氯地平原料药的手性杂质，以羧甲基β-环糊精（CM-β-CD）为手性选择剂，并对背景电解液的pH、手性选择剂浓度、缓冲液浓度、毛细管温度和电压几个参数进行了手性分离优化。测定的手性杂质R-氨氯地平含量为0.2%。所建立的方法中，LOD和LOQ分别为0.001和0.003 g·L-1。该法快速高效，进一步应用于左旋氨氯地平制剂中手性杂质的检测。Mikuma等[34]采用CE-MS检测8种安非他命类精神药物中甲基苯丙胺类手性杂质。该研究首次采用了磺酸基团经化学修饰的毛细管，通过CE-MS/MS进行杂质分析。16个手性杂质在60 min内达到基线分离，并获得它们精确的质谱信息。

超临界流体色谱（SFC）技术作为气相色谱和液相色谱的有力补充，兼有二者优点，其在手性药物杂质分析和天然高分子化合物制备中有着重要应用。Marley等[35]采用SFC法检查S-马来酸噻吗洛尔原料药中R-马来酸噻吗洛尔杂质。该法比非水毛细管电泳法（NACE）和《欧洲药典》中公布的正相高效液相色谱法（NP-HPLC）分析速度快、消耗溶剂量小，显示了SFC检测手性杂质的潜力。Li 等[36]开发了一种新型的SFC方法测定利福平中的4个杂质，与传统的反相液相色谱法（RPLC）相比，该法更加绿色、快速、高效。

2.2.3 遗传毒性杂质遗传毒性杂质在极低水平便能与DNA相互作用，具有很高的致癌致突变风险。因此对遗传毒性杂质及潜在遗传毒性杂质（PGI）的研究极其重要。Reddy等[37]对化学药物开发中经常遇到不同结构类型的遗传毒性杂质进行分类和综述，帮助研究者研究潜在遗传毒性杂质。遗传毒性杂质的限度远低于ICH Q3A、Q3B的限度水平，需要结合杂质结构特征，开发选择性和灵敏度高的痕量检测方法。一些遗传毒性警示结构如卤代烷、磺酸酯和肼类缺乏紫外生色基团，可以采用衍生化LC-UV等方法[38]。

GC-MS是挥发性遗传毒性杂质检测不可或缺的工具。通常情况下，顶空气相色谱和GC-MS是分析卤化物、磺酸盐和环氧化物的首选技术[39]。Gar cí a等[40]采用GC-MS法测定了氯哌斯汀芬地柞酸盐中的烷基卤化物遗传毒性杂质。Harigaya等[41]采用GC-MS法测定四氢呋喃和盐酸在原料药合成过程中生成的4-氯-1-丁醇，并对药物临床试验中该遗传毒性杂质进行测定。LC-MS是药物遗传毒性杂质定量分析的重要且有效方法之一。Ding等[42]采用丹酰衍生化的LC-MS/MS法对3种原料药中遗传毒性杂质2-羟基吡啶-N-氧化物（HOPO）进行定量测定。Guo等[43]采用LC-MS法系统测定了12种潜在的磺酸酯遗传毒性杂质，同时该课题组还比较了电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）2种电离方式，证明在检测中APCI法优于ESI法。研究人员发现在ESI条件下，会出现更多的加合离子与前体离子竞争，因而灵敏度和重现性较差；而在APCI条件下，杂质能够产生稳定的前体离子[M-烷基]-，经碰撞诱导解离(CID)作用更易产生产物离子[M-烷基-CH3]-和[M-烷基-SO2]-，在选择性反应监测（SRM）模式下被检测，并获得良好的精密度和极低的检测限度。也有研究者采用CE-MS法检测药物中潜在遗传毒性杂质卤代烷。例如，van Wijk等[44]将药物与烷化剂4-二甲基氨基吡啶（DMAP）或1-丁基-（吡啶-4-基）哌啶-4-羧酸乙酯（BPPC）衍生化，经毛细管区带电泳（CZE）分离，MS检测卤代烷。该法具有较高的专属性和灵敏度，可以代替LC-MS法对遗传毒性杂质卤代烷的检测。

3 杂质限度的制定

3.1 有关物质限度制定方法

在ICH Q3A、Q3B[19,45]的指导原则中将杂质限度定义为：在特定水平下单个杂质或给定杂质谱的生物学安全性资料的获得和评价过程。该指导原则通过制定杂质的报告、鉴定和认证阈值监管杂质。有关物质的控制一般包括每个明确的已知杂质、每个明确的未知特定杂质、任何非特定杂质以及总杂质。杂质限度的确定首先要有充分的安全性依据，结合药物工艺路线，综合药学、药理毒理及临床研究结果判定；其次，在排除为遗传毒性杂质的情况下，可综合考虑生产的可行性和产品的稳定性制定合理的杂质限度[46]。杂质限度应考虑患者人群、每日剂量、给药途径、用药持续时间等因素。对于仿制药来说，有关物质限度的确定可以参考原研药上市标准、各国药典和国家标准来制定杂质合理限度，衔接上市药物安全有效性信息[47]。

3.2 遗传毒性杂质限度制定方法

近年来，遗传毒性杂质限度控制的法规逐步健全，2006年EMA公布了遗传毒性杂质限度指南的最终版[48]，2008年底美国FDA发布了遗传毒性杂质指南草案[49]，以及由美国药物研究和制造商协会（PhRMA）发布的PhRMA意见书[50]，这些指南均针对遗传毒性杂质的检测、分类和风险评估提供了指导性建议和技术要求。ICH于2014年7月15日正式发布了《基因毒性杂质指南M7》[51]，为遗传毒性杂质的鉴别、分类、定量分析和控制提出了切实可行的依据和方法，弥补EMA及FDA关于遗传毒性杂质控制指南在某些方面存在的不确定性和分歧[52]。

ICH发布的《基因毒性杂质指南M7》根据风险级别将遗传毒性杂质分为5 个类别。首先对合成路线中的工艺杂质、试剂和中间体等PGI进行结构评估，通过数据库检索其毒性数据及致癌可能性，鉴定警示结构。除采用数据库检索外，还可采用（Q）SAR方法进行预测，包括依据专家规则和统计学方式2个相互补充的（Q）SAR预测方法，然后对杂质进行分类控制，建立基于每日允许摄入量和毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）概念的杂质限量标准。TTC可以通用于大部分药物，作为默认的可接受限度控制标准。分期TTC法列出了临床试验中不同暴露时间推荐的TTC水平，暴露时间大于10年、1～10年、1～12个月和少于1个月的日摄入量接受限度分别为1.5、10、20 和120 μg·d-1。在确定潜在毒性杂质是否为毒性杂质时，还需要进行体外细菌回复突变试验（Ames试验）。

有些强遗传毒性致癌物质如黄曲霉素类、N-亚硝基类、偶氮类化合物的可接受摄入量不适用于TTC法，这类化合物的风险评估需要有特定化合物的毒性数据[53]。

4 展望

目前，化学药物杂质研究在杂质前处理方法、杂质快速高效分离、微量杂质定性定量分析、色谱联用技术等方面不断发展。杂质谱使得药物杂质的分析和控制思路更加明晰，依据杂质谱信息，运用不同原理的分析方法相互补充与验证，以确保杂质的有效检出。在评估杂质安全性的基础上，根据相关指导原则制定合理的杂质限度。化学药物杂质研究是化药质量控制的重要方面，贯穿于整个药物研究过程。相信随着分析新技术的出现和应用以及我国药物质量控制标准更加严格规范化，药物杂质研究必将更加透彻，药物使用将更加安全有效。

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《中国药学年鉴》2014卷征订启事

《中国药学年鉴》是一部连续记载我国药学领域发展概貌和重要成就的大型编年史册，1982年由卫生部创刊，中国药科大学牵头组织全国著名药学专家编纂，中国工程院彭司勋院士担任主编。

《中国药学年鉴》是涵盖我国药学领域各个方面的药学综合性年刊，内容包括专论、药学研究、新药研发、药学教育、药品生产与流通、医院药学、药品监管、人物、书刊、学会与学术活动、大事记等。创刊30年来，本书以其密集的信息、翔实的年报统计资料，深受读者的欢迎和喜爱，成为医药单位不可或缺的馆藏书目，和医药工作者常备常考的工具书。

《中国药学年鉴》2014卷于2015年4月出版，面向海内外公开发行，定价：320元/本。

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DRUG REGISTRATION AND EVALUATION

Advances in Researches on Impurities in Chemical Drugs

YUE Yue1,2, LUO Xuefang1, ZHONG Wenying1, HOU Wen2

(1.Department of Analytical Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2.Nanjing Cavendish Bio-Engineering Technology Co., Ltd., Nanjing 210033, China)

Analysis and control of drug impurities are the basics for effective and safe use of drugs.This paper reviews the advances in researches on impurities in chemical drugs from the aspects of impurity profiling, impurity detection and formulation of impurity limit, so as to provide constructive ideas and effective methods for researches on impurities in chemical drugs.

impurity pro fi le; impurity detection; impurity limit; related substance; chiral impurity; genotoxic impurity

TQ460.72

A

1001-5094（2015）07-0533-07

接受日期：2015-05-20

*通讯作者：钟文英，教授；

研究方向：现代药物分析及分析化学；

Tel：025-86185217；E-mail：wenyingzhongnj@163.com