重组日本七鳃鳗毒素蛋白rLj-RGD3及其4种突变体抗血小板聚集活性的比较

吕莉，王继红，邵钫钰，郑媛媛，王跃，李玲欣，肖蓉，李庆伟*

(1.辽宁师范大学海洋生物功能基因与蛋白质组学研究所，辽宁大连116029;2.大连医科大学药理教研室，辽宁大连116044)

重组日本七鳃鳗毒素蛋白rLj-RGD3及其4种突变体抗血小板聚集活性的比较

吕莉1，2，王继红1，邵钫钰2，郑媛媛1，王跃2，李玲欣1，肖蓉1，李庆伟1*

(1.辽宁师范大学海洋生物功能基因与蛋白质组学研究所，辽宁大连116029;2.大连医科大学药理教研室，辽宁大连116044)

目的初步探讨rLj-RGD3分子中3个RGD模体对野生型rLj-RGD3抗血小板聚集活性的作用。方法全序列人工合成并重组表达、纯化4种rLj-RGD3缺失突变体蛋白。制备富血小板血浆(PRP)，与不同浓度各重组突变体蛋白共温浴，采用Born氏比浊法测定ADP诱导的血小板聚集率，并计算血小板聚集抑制百分率，以评价野生型rLj-RGD3及其4种突变体蛋白的抗血小板聚集活性。结果成功重组表达纯化4种可溶性rLj-RGD3缺失突变体蛋白，rLj-RGD3抗血小板聚集活性最高，rLj-RGD3-0不具有抗血小板聚集功能，rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2及rLj-RGD3-3活性相当。结论3个RGD模体在rLj-RGD3抗血小板聚集功能中均十分重要，并不分伯仲，而rLj-RGD3因分子中含有3个RGD模体而活性最强。

七鳃鳗;rLj-RGD3;突变体;血小板;血小板聚集

RGD 毒素肽是某些有毒生物唾液腺分泌物中特有的以RGD(Arg-Gly-Asp)为特征性模体的生物活性肽，具有抗肿瘤、抗血小板聚集等功能［1］。重组日本七鳃鳗RGD毒素肽rLj-RGD3为源自于海洋洄游鱼类日本七鳃鳗口腔腺的可溶性蛋白，由118个氨基酸组成，理论分子量为1.36×104，其一级结构中含有3个RGD模体。本研究组先期研究发现rLj-RGD3凭借其分子中含有的3个RGD模体而具有抗血小板聚集功能［2］。为探明其3个RGD模体的作用方式，本研究对野生型rLj-RGD3进行RGD模体的缺失突变，并对rLj-RGD3及其突变体蛋白的抗血小板聚集活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

pET23b质粒、BL21菌，由辽宁师范大学海洋生物功能基因与蛋白质组学研究所实验室提供;4种rLj-RGD3突变体合成基因，由大连宝生物工程有限公司提供;组氨酸亲和层析柱(His·Bind Column)，德国Novagen公司产品;质粒提取试剂盒、IPTG、NdeⅠ及HindⅢ均购自大连宝生物工程有限公司;枸橼酸钠，浙江杭州萧山化学试剂厂产品;ADP，购自上海solarbio生物科技公司;LBY-NJ2血液凝聚仪，北京普利生仪器有限公司产品。

1.2 野生型rLj-RGD3及其四种突变体蛋白的基因

合成、蛋白质诱导表达、纯化

按文献［3-5］方法，对4种rLj-RGD3缺失突变体rLj-RGD3-0、rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2、rLj-RGD3-3进行基因全序列人工合成，以NdeⅠ与HindⅢ为酶切位点构建pET23b载体获得基因重组质粒，以CaCl2法将获得的阳性基因重组质粒转化入表达菌BL21大肠杆菌中，用IPTG诱导表达重组蛋白，以组氨酸亲和层析柱(His·Bind Column)进行纯化蛋白，并采用Tricine SDS-PAGE小分子量蛋白质电泳法鉴定各重组蛋白。

1.3 野生型rLj-RGD3及其4种突变体蛋白抗血小

板聚集活性的比较

采集健康志愿者静脉血，以3.8%枸橼酸钠(按血与抗凝剂体积比9∶1)抗凝，1 000 rpm离心5 min取上清即得富血小板血浆(PRP)，余血经3 000 rpm离心10 min，获得贫血小板血浆(PPP)，以PPP调PRP使血小板数至3×108/L，将不同浓度的各重组蛋白与PRP预温(空白对照加入等容量生理盐水)，以ADP(终浓度3μmol/L)为诱导剂，按Born氏比浊法［6］分别于血液凝聚仪中测定血小板5 min最大聚集率，并计算血小板聚集抑制百分率。血小板聚集抑制百分率(%)=［(对照组血小板聚集%－给药组血小板聚集%)/对照组血小板聚集%］×100%。

2 结果

2.1 野生型rLj-RGD3及其4种突变体蛋白的基因合成、蛋白质诱导表达、纯化

人工合成的4种缺失突变体 rLj-RGD3-0、rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2、rLj-RGD3-3基因序列经测序证实其序列均完全正确。野生型rLj-RGD3及其4种缺失突变体的cDNA序列及其推导的氨基酸序列如图1所示。

采用人工合成基因序列并通过分子克隆方法成功获得了4种rLj-RGD3缺失突变体的基因重组蛋白的可溶性表达。其经组氨酸亲和层析纯化后小分子量蛋白质电泳鉴定结果如图2所示。将制备的各重组蛋白定量后进行抗血小板活性的比较。

图1 野生型rLj-RGD3及4种突变体的cDNA序列及其推导的氨基酸序列

图2 亲和层析纯化蛋白的Tricine SDS-PAGE电泳图

2.2 野生型rLj-RGD3及其4种突变体蛋白抗血小

板聚集活性的比较

如图3所示，野生型rLj-RGD3较缺失突变的4种突变体的抗血小板聚集活性均高，其仅含一个RGD模体的3种突变体活性相当，而将RGD模体全部缺失的rLj-RGD3-0不具有抗血小板聚集活性。提示，3个RGD模体在抗血小板功能中均十分重要，并不分伯仲，而rLj-RGD3因分子中含有3个RGD模体而活性最强。

图3 rLj-RGD3及4种突变体对ADP诱导的人血小板聚集活性的影响

3 讨论

RGD毒素肽因其分子中的RGD模体能专一性地与血小板纤维蛋白原受体——糖蛋白GPⅡb/Ⅲa结合，竞争性地拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，防止血小板的活化和GPⅡb/Ⅲa受体构象的改变，从而抑制血小板聚集的最终共同通路，产生抗血栓形成作用［7］。本研究中受试的野生型Lj-RGD3分子中含有3个RGD模体，前期实验结果已证实其具有抗血小板凝集的生物学活性［2］。为了研究其结构与功能的关系，本研究对其基因进行了缺失突变，并重组表达了4种可溶性重组蛋白rLj-RGD3-0、rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2和rLj-RGD3-3。由于野生型rLj-RGD3基因含大量重复序列，定点突变困难，因而本实验对缺失突变体进行了全序列合成，其中rLj-RGD3-0为缺失掉全部RGD模体，rLj-RGD3-1、rLj-RGD3-2和rLj-RGD3-3分别保留第一位、第二位和第三位RGD模体，它们的分子量均为1.5×104。

抗血小板活性的比较结果显示，分子中不含有RGD模体的缺失突变体rLj-RGD3-0不具有抗血小板聚集活性，仅含一个RGD模体的另3种突变体活性相当，而含有3个RGD模体的野生型rLj-RGD3抗血小板聚集活性最高。可见，RGD模体是RGD毒素蛋白rLj-RGD3具有抗血小板聚集活性的结构基础，但三个位置上的RGD对其产生活性的贡献并不分伯仲，而rLj-RGD3正是因其分子中含有3个RGD模体而具强大的抗血小板聚集作用。

［1］Careya CM，Bueno R，Gutierrez DA，et al.Recombinant rubistatin(r-Rub)，an MVD disintegrin，inhibits cell migration and proliferation，and is a strong apoptotic inducer of the humanmelanoma cell line SK-Mel-28［J］.Toxicon，2012，59(2):241-248.

［2］Wang Jihong，Han Xiaoxi，Yang H，et al.A novel RGD-toxin protein，Lj-RGD3，from the buccal gland secretion of Lampetra japonica impacts diverse biological activities［J］.Biochimie，2010，92(10):1387-1396.

［3］ 张亚前，李庆伟，吕莉，等.日本七鳃鳗Lj-RGD3缺失突变体Lj-113人工合成序列的基因克隆与蛋白表达［J］.吉林医药学院学报，2011，32(2):73-76.

［4］Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.分子克隆实验指南［M］.金冬雁，黎需枫，译.2版.北京:科学出版社，1992:55-56，304-313.

［5］Schgger H，von Jagow G.Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa［J］.Anal Biochem，1987，166(2):368-379.

［6］Born Gustav VR.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal［J］.Nature，1962，194 (4832):927-929.

［7］Sánchez EE，Galán JA，Russell WK，et al.Isolation and characterization of two disintegrins inhibiting ADP-induced human platelet aggregation from the venom of Crotalus scutulatus scutulatus(Mohave Rattlesnake)［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2006，212(1):59-68.

The com parison of rLj-RGD3，a kind of recombinant toxin protein from Lampetra japonica，and its 4 mutants on anti-p latelet aggregation activities

LLi1，2，WANG Jihong1，SHAO Fangyu2，ZHENG Yuanyuan1，WANG Yue2，LILingxin1，XIAO Rong1，LIQingwei1*
(1.Department of Biological Sciences，Liaoning Normal University，Dalian，Liaoning Province，116029;2.Department of Pharmacology，Dalian Medical University，Dalian，Liaoning Province，116044，China)

ObjectiveTo investigate the effects of the three RGD motifs ofwild rLj-RGD3 on its anti-platelet aggregation activity.MethodsGene sequences of4 deletionmutantswere synthesized and the 4 kinds of recombinant deletion mutant proteinswere expressed and purified.Platelet-rich plasma(PRP)was prepared.Different concentrations of the recombinantmutant proteinswere added into PRP，separately.ADP-induced platelet aggregation rates were determined by using Born's turbidimetrymethod.Then the inhibition rates of platelet aggregation were calculate to evaluate the anti-platelet activities of rLj-RGD3 and itsmutants.ResultsThe four kinds of purified recombinant soluble rLj-RGD3 deletionmutant proteinswere obtained successfully.rLj-RGD3 exhibited the highestanti-plateletaggregation activity，rLj-RGD3-0 did nothave anti-platelet aggregation effect，rLj-RGD3-1，rLj-RGD3-2 and rLj-RGD3-3 exhibited middle anti-platelet aggregation activity equally.ConclusionEach RGD motif plays a very important role in rLj-RGD3 on its anti-platelet aggregation function at the same level，and wild rLj-RGD3 has a strong anti-platelet aggregation activity because of its three RGD motifs.

Lampetra japonica;rLj-RGD3;mutant;platelet;platelet aggregation

Q78

A

1673-2995(2015)03-0164-03

2015-01-14)

国家自然科学基金(81202455);国家高技术研究发展863计划资助项目(SS2014AA091602);国家海洋公益项目(201305016-5).

吕莉(1972－)，女(汉族)，副教授，在读博士.

李庆伟(1955－)，男(汉族)，教授，博士.