七叶莲总三萜的提取工艺及其含量测定

何定峰， 洪佳妮， 徐先祥， 秦 思

（1.福建省泉州市中医院，福建泉州362000；2.华侨大学生物医学院，福建泉州362021）

七叶莲总三萜的提取工艺及其含量测定

何定峰1， 洪佳妮1， 徐先祥2*， 秦 思2

（1.福建省泉州市中医院，福建泉州362000；2.华侨大学生物医学院，福建泉州362021）

目的 考察比色法测定七叶莲中总三萜含有量的显色条件，并对其提取工艺进行优化。方法 以齐墩果酸为对照品，对显色条件进行考察，包括5%香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、水浴温度、反应时间，建立测定条件。再以总三萜含有量为指标，采用正交试验法对提取工艺进行优化。结果 5%香草醛-冰醋酸溶液用量以0.3 mL为宜，高氯酸用量以1.2 mL为宜，水浴温度以70℃为宜，反应时间以20 min为宜，并于显色后30 min内进行测定。优选的提取工艺为以95%乙醇为溶剂，料液比1∶10，回流提取60 min，此工艺下总三萜的平均质量分数为22.58%。结论在优选的显色条件下，该方法操作简便快速、灵敏度高、结果稳定、重现性好，并且工艺稳定可行，可应用于七叶莲总三萜成分的提取。

七叶莲；总三萜；显色条件；提取工艺；比色法；正交试验

七叶莲又名七叶藤、汉桃叶，为五加科植物七叶莲Schefflera arboricola Hayata的干燥茎叶，主要分布于广东、广西、福建、台湾等地，以根、茎、叶入药［1］。其味苦、甘，性温，有散瘀止痛，活血消肿之功效，临床上主要用于风湿关节痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、胃及十二指肠溃疡疼痛等症状［2］。近年来，七叶莲在化学成分、药理作用方面有大量研究［3-6］，发现该植物除含有机酸、挥发油、蜕皮激素等成分外，主要为齐墩果烷型三萜及其苷类［2，7］。药理研究表明，三萜类化合物具有广泛的生理活性，如消炎抗菌、镇痛、抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、增加免疫力、保肝解毒等［8-9］。目前关于七叶莲三萜类成分的研究很少，本实验利用比色法测定七叶莲总三萜的含有量，考察最适宜的显色条件，并采用正交试验设计对其提取工艺进行优化，旨在为该植物的进一步开发及应用提供研究基础。

1 材料

Sartorius BSA124S型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；DJ-04型中药粉碎机 （上海淀久中药机械制造有限公司）；HH-1型电热恒温水浴锅 （江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；KQ 500E型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；RE 52-86A型旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）；UV-2450型紫外-可见分光光度计 （日本岛津公司）。

七叶莲药材 （福建省泉州中侨集团股份有限公司药业公司），经本院汤少陵主管中药师鉴定为七叶莲S.arboricola Hayata的干燥茎叶。齐墩果酸对照品 （含有量测定用，批号201206，中国食品药品检定研究院）。香草醛、冰醋酸、高氯酸、95%乙醇、甲醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试溶液的制备 取干燥至恒重的七叶莲药材，粉碎过筛，称定20.00 g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入15倍量75%乙醇，水浴加热，回流提取60 min，提取液过滤，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥。再精密称定提取物20 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，稀释至刻度，即得。

2.2 标准溶液的制备 精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

2.3 显色工艺的考察

2.3.1 显色波长的确定 参照文献 ［10］，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法进行显色。分别精密吸取标准溶液、供试溶液0.5 m L，置于具塞试管中，水浴挥干，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL混匀，密塞，60℃水浴中加热20 min，取出，冰水浴冷却10 min，加冰醋酸5 mL，摇匀。然后，不加供试溶液而加显色剂溶液，同法制得空白对照液，紫外-可见分光光度计进行全波长扫描，根据扫描结果，取最大吸收峰处波长541 nm作为检测波长，见图1。

2.3.2 5%香草醛-冰醋酸用量考察 精密吸取标准溶液0.5 mL 6份，水浴蒸干后分别加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，然后再分别加入高氯酸0.8 m L，置于60℃水浴中加热15 min后取出，冰水浴冷却10 m in，加入冰醋酸5.0 mL，摇匀，置于室温下15 min后测定其吸光度，结果见图2。根据结果，选定5%香草醛-冰醋酸溶液的最佳用量为0.3 mL。

图1 香草醛-冰醋酸-高氯酸法显色后的吸收光谱图

图2 5%香草醛-冰醋酸用量对显色体系的影响

2.3.3 高氯酸用量考察 精密吸取标准溶液0.5 mL 6份，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，再加入高氯酸0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，60℃水浴中加热15 min后取出，冰水浴冷却10 min，加入冰醋酸5.0 mL，摇匀，置于室温下15 min后测定其吸光度，结果见图3。根据结果，选定高氯酸的最佳用量为1.2 mL。

图3 高氯酸用量对显色体系的影响

2.3.4 水浴温度的考察 精密吸取标准溶液0.5 mL 5份，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸溶液1.2 mL，分别于40、50、60、70、80℃水浴加热15 min。同时，做空白对照，测定不同水浴温度下的吸光度值，并观察各温度下空白颜色是否发生变化，结果见图4。由图可知，吸光度随温度的升高而增加，但超过70℃时，空白液颜色开始发生变化，故确定最佳水浴温度为70℃。

2.3.5 反应时间的考察 精密吸取标准溶液0.5 mL 5份，分别水浴10、15、20、25、30 min，然后测定其吸光度，结果见图5。由图可知，水浴加热10～20 m in时，吸光度值急剧增加，20 min后缓慢递增，但时间过长会导致空白液颜色发生变化，故选定最佳反应时间为20 min。

图4 水浴温度对显色体系的影响

图5 反应时间对显色体系的影响

2.4 方法学考察与总三萜测定

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取标准溶液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mL，置于具塞试管中，水浴蒸干，再依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸1.2 mL混匀，密塞，70℃水浴中加热20 min，取出冷却至室温后，加冰醋酸5 mL定容至刻度，摇匀。再以显色剂为空白，于541 nm处测定吸光度值 （A）。以A为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标 （C）绘制标准曲线，得回归方程A=41.795C-0.013 1（r=0.999 1），线性范围为1.54～13.85 mg/L，表明线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 精密吸取标准溶液6份，每份0.5 mL，进样分析，得RSD为0.60%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验精密称取同一批样品6份，按 “2.1”项下方法制备供试品溶液，得RSD为1.55%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取同一供试溶液0.5 mL，分别于显色后0、15、30、45、60、90 min测定吸光度，得30 min内的RSD为1.26%，而30 min后稳定性开始下降。因此，该溶液在30 min内稳定性良好，即应在显色后30 min内进行测定。

2.4.5 加样回收试验 精确称取含有量已知的供试溶液6份，每份0.3 mL，分别精密加入标准溶液0.2 mL，进样分析，计算平均加样回收率，结果见表1。

2.5 总三萜提取方法的考察

2.5.1 提取步骤 精密称取七叶莲粉末9份，每份20.00 g，分别置于圆底烧瓶中，加入相应浓度和体积的乙醇，水浴加热，按相应时间进行回流提取，提取液过滤，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥。再精密称定提取物20 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，稀释至刻度，即得供试溶液。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.5.2 因素水平和方差分析 根据前期单因素试验考察情况，选取乙醇体积分数、料液比、提取时间这3个影响提取物总三萜含有量的主要因素，每个因素设3个水平 （表2），进行L9（33）正交试验，见表3，方差分析结果表4。由表3可知，各因素影响顺序依次为A＞C＞B，即乙醇体积分数对提取结果的影响最大，其次为提取时间、料液比。由表4可知，乙醇体积分数有显著影响 （P＜0.05）。因此，结合实际生产考虑，最佳提取工艺参数组合为A3B1C2，即以95%乙醇为溶剂，料液比1∶10，回流提取60 min。

表2 因素水平

表3 正交试验结果

表4 方差分析结果

2.5.3 验证试验 按优选的工艺提取3次，得到总三萜的质量分数分别为23.02%、22.32%、22.40%，平均质量分数为22.58%，RSD为1.69%，表明该优化工艺稳定可行。

3 讨论

中药总三萜类成分的的测定一般采用分光光度法［11］，常用的显色体系有香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-冰醋酸-硫酸和香草醛-乙醇-硫酸［12-14］。经预实验筛选，选用香草醛-冰醋酸-高氯酸作为比色法测定七叶莲总三萜量的显色剂，但显色剂的用量、反应温度及时间、反应后放置时间等因素对结果的影响较大，因此对显色条件进行考察。结果发现，5%香草醛-冰醋酸溶液用量以0.3 mL为宜，高氯酸用量以1.2 mL为宜，水浴温度以70℃为宜，反应时间以20 m in为宜，并于显色后30 min内在541 nm波长下进行测定。该方法操作简便快速、灵敏度高、测定结果稳定、重现性好但，测定时应注意控制反应温度和时间。

以提取物总三萜得率为指标，经正交试验优化的七叶莲总三萜最佳提取工艺参数为以95%乙醇为溶剂，料液比1∶10，水浴回流提取60 min。经验证，该提取工艺稳定可行，可作为七叶莲总三萜成分的提取工艺。

七叶莲总三萜含有量的测定方法及提取工艺尚未见报道，本实验考察比色法测定的显色条件，并以正交试验对其提取工艺进行优化，这为该植物有效成分的进一步开发提供研究基础。

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R284.2

B

1001-1528（2015）12-2761-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.042

2014-07-29

福建省科技计划重点项目 （2012Y0049）；泉州市卫生局科研资助项目

何定峰（1965—），男，副主任药师，研究方向为医院药学。E-mail：Dingfenghe@hotmail.com

*通信作者：徐先祥，男，副研究员，研究方向为中药药理学。E-mail：xuxianxiang@163.com