不同激素对银杏愈伤组织黄酮积累的影响

胡选萍， 张晓娟， 任鹏斌， 苗梦瑶

（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

不同激素对银杏愈伤组织黄酮积累的影响

胡选萍， 张晓娟， 任鹏斌， 苗梦瑶

（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

目的 研究不同激素对银杏愈伤组织的影响，探讨黄酮积累的最佳培养基。方法 以银杏种子胚为材料，正交试验法确定2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤这4种激素对银杏愈伤组织诱导及黄酮积累量的影响。结果 萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤对银杏种子胚愈伤诱导率与黄酮积累影响显著。最佳愈伤组织诱导激素组合为1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤；最佳黄酮积累激素组合为3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。结论 该条件下银杏愈伤诱导率和黄酮产量较理想，可用于银杏愈伤积累黄酮的培养。

银杏；愈伤组织；激素；黄酮积累；正交试验

银杏Ginkgo biloba L.是国际上近代植物药研究开发的热点之一［1-2］，《本草纲目》记载，其 “性味甘苦而涩，入肺、肾二经，有定喘止咳、止带浊、缩小便” 的功效［3］。银杏提取物主要含有银杏黄酮和萜类内酯这两大活性成分，其中前者包括槲皮素、异鼠李素、山柰素这3种苷元与糖基结合形成的黄酮醇苷，而后者主要由白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C组成。据报道，黄酮类成分在抗氧化、抗衰老、提高免疫机能和防治心血管疾病方面疗效显著［4-5］，已经在医药领域得到广泛开发。目前，利用银杏愈伤组织细胞培养技术生产黄酮类次生代谢产物成为近年来发展的新领域［6-7］，但由于其品质与特性差异，往往造成产量偏低，很难满足工业化生产的需要。许多研究者从不同角度探索银杏离体培养条件及激素类物质对银杏愈伤诱导与黄酮积累的影响［8-10］，但相关研究多采用单因素和双因素试验，并未综合分析各种激素组合的优化效果。本实验以银杏种子胚为试材，以2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤这4种激素为考察因素，采用4因素3水平正交试验设计，分析不同激素组合处理对银杏愈伤组织诱导和黄酮积累的影响，并优化其条件，为后期的悬浮培养及工业化生产提供一定技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 银杏Ginkgo biloba L.种子采自陕西省汉中市陕西理工学院校园内约30年生银杏树的当年生种子。2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤均为分析纯。MS为基本培养基，自制。

1.2 仪器 LDZX-50FBS型立式压力灭菌器（上海申安医疗器械厂）；SW-CJ-2D型双人单面洁净工作台 （上海苏净实业有限公司）；HHS-4S电子恒温不锈钢水浴锅 （上海轧艮仪器设备有限公司）；722G型可见分光光度计 （上海圣科仪器设备有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 愈伤组织的诱导 选取色泽鲜亮、大小一致的银杏种子，剥掉肉质外种皮，流水冲洗30 min，装入消毒好的广口瓶中，75%乙醇表面消毒30 s，0.1%升汞（HgCl2）浸泡10 min，处理过程中不断摇动，以保证消毒液与试材充分接触，无菌蒸馏水冲洗4～5次，每次2～3 min，置于无菌滤纸上吸干水分。无菌操作时剥开种子，取出胚，接种至附加不同激素组合的MS诱导培养基，置于温度（25±2）℃、散射光条件下培养30 d，即可诱导出愈伤组织。

1.3.2 诱导培养基的选择 以MS为基本培养基，以2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤为考察因素，选用L9（34）正交表，每个因素设3个水平，见表1。

1.3.3 愈伤组织的继代培养 将各处理诱导出的愈伤组织在对应培养基 （与诱导培养基激素种类与浓度配比相同）中连续继代3次后，测定黄酮的含有量。

1.3.4 总类黄酮的提取与测定 参照文献 ［11-12］，采用芦丁标准曲线法测定黄酮含有量。

2 结果与分析

2.1 银杏愈伤组织的诱导 将银杏种子胚外植体接种到不同激素的培养基上，第3天开始有少量愈伤组织形成，5～10 d是愈伤的快速诱导期，2周左右达到高峰，第30天所有处理均可诱导出愈伤组织，诱导率达100% （图1）。大多试验处理诱导出的愈伤组织为黄绿色 （图2），少数为白色、绿色或浅黄色，愈伤组织质地疏松或致密，生长情况也不尽量相同 （表2）。

图1 不同培养时间愈伤诱导率比较

图2 银杏胚诱导的愈伤组织

表2 银杏种子胚愈伤组织诱导的基本情况

2.2 对愈伤诱导率的影响 激素的种类和浓度是银杏愈伤组织培养的重要影响因素。由于第10天是银杏愈伤组织诱导的拐点，之后诱导率基本趋于稳定 （图1），因此将这时期各激素对诱导率的影响进行统计分析，有助于判断其效应水平及筛选银杏愈伤诱导的最优组合。以愈伤诱导率为指标，进行直观分析与方差分析，结果见表3和表4。由表3可知，各因素对银杏愈伤诱导率的影响依次为C＞D＞B＞A，即6-苄基腺嘌呤＞呋喃氨基嘌呤＞萘乙酸＞2，4-二氯苯氧乙酸，最佳激素组合为A1B1C1D2，即培养基中的激素组合为1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。由表4可知，萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤对银杏愈伤诱导率具有显著影响，而2，4-二氯苯氧乙酸则无明显影响。

表3 银杏愈伤组织诱导的正交试验结果分析

表4 银杏愈伤诱导率的方差分析

2.3 对黄酮积累量的影响 以银杏愈伤组织中的黄酮含有量为指标，分别进行直观分析 （表5）与方差分析 （表6）。由方差分析结果可知，萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤对银杏愈伤组织中的黄酮积累具有显著影响（P＜0.01），而2，4-二氯苯氧乙酸则无明显影响。通过直观分析比较4个因素的极差值，发现D最大，其次是C，B较小，而A最小，其效应依次为呋喃氨基嘌呤＞6-苄基腺嘌呤 ＞萘乙酸 ＞2，4-二氯苯氧乙酸，最优组合为A3B1C3D2，即培养基中激素组合为3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。

表5 银杏黄酮含有量的正交试验结果

表6 银杏黄酮含有量的方差分析

3 讨论

激素作为植物生长调节剂，对愈伤组织的诱导有着独特的调控作用。胡蕙露等［13］研究发现，培养基中萘乙酸和6-苄基腺嘌呤的质量浓度分别为0.5 mg/L与0.1 mg/L，当附加0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤时，有利于银杏茎段愈伤组织诱导。王洪善等［14］报道，以银杏嫩茎作外植体组织培养的最佳培养基激素配比为0.8～1.0 mg/L萘乙酸与1.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤。朱红威等［15］研究结果表明，激素对胚的愈伤化程度影响比较大，6-苄基腺嘌呤较呋喃氨基嘌呤更有利于愈伤组织的诱导。本实验将4种激素同时配合使用，取得了良好的愈伤诱导效果，虽然各试验组在培养30 d后均能诱导出愈，但在愈伤组织快速形成期存在明显差异。综合考虑各激素对愈伤诱导效应、愈伤品质以及愈伤组织生长量的影响，发现有利于银杏愈伤组织诱导的最优激素组合为1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。激素之间的相互作用非常复杂，不同激素如何影响愈伤形成速度而不影响最终诱导水平尚有待作进一步研究。

在组织培养中，因培养目的与材料的不同，在培养基中通常加入一种或几种激素类物质，其质量浓度或组合的稍加改变，往往能造成次生代谢产物含有量的显著变化。如哈斯其美格等［16］在唐古特大黄研究中发现，2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸非常有利于蒽醌的积累。Carrier等报道［17］，萘乙酸与6-苄基腺嘌呤组合可提高银杏黄酮苷的含有量。胡燕梅等［18］发现，低质量浓度激素0.1 mg/L萘乙酸与0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤有助于银杏胚愈伤组织中黄酮积累。本实验采用4因素3水平正交设计，显示萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤对银杏愈伤组织中的黄酮含量具有显著影响，而且当培养基中激素组合为3.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤时，最有利于黄酮的积累。朱红威等［15］研究发现，促进银杏胚愈伤组织产黄酮的最佳激素组合为0.3 mg/L 6-苄基腺嘌呤与2.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，黄酮含有量最高可达到0.013 mg/kg，而本实验采用继代3次的愈伤组织为试材，各试验组黄酮平均含有量达0.023 5 mg/kg，但愈伤组织在长期继代中是否能始终保持较强的次生代谢物的合成能力值得作进一步研究。

［1］ Hasler A，Stider O.Identification and determination of the flavonoids from Ginkgo biloba by high performance liquid chromatography［J］.JChromatogr A，1992，60（5）：41-48.

［2］ Laurain D，Tremoiullaux G J，Chenieux J，et al.Production of ginkgolide and bilobalide in transformed and gametophyte derived cell cultures of Ginkgo biloba［J］.Phytochemistry，1997，16（1）：127-130.

［3］ 何 键.银杏叶的研究进展［J］.中国药房，2011，22（15）：1434-1436.

［4］ 王飞娟.银杏叶中黄酮类化合物的研究进展［J］.西北药学杂志，2010，25（2）：155-156.

［5］ 陈西娟，王成章，叶建中.银杏叶化学成分及其应用研究进展［J］.生物质化学工程，2008，42（4）：57-62.

［6］ 秦卫东，高明侠，吕兆启.银杏愈伤组织培养及其黄酮生物合成的初步探讨［J］.食品科学，2002，23（11）：38-41.

［7］ 朱红威，马 毅，叶 翔，等.银杏愈伤组织细胞中总黄酮提取工艺的比较［J］.中国农学通报，2011，27（30）：237-240.

［8］ 张德华，张占甲，陈坤明，等.银杏组织培养研究Ⅰ.不同培养条件对银杏愈伤组织形成的影响［J］.西北植物学报，1994，14（6）：29-32.

［9］ 杜希华，孙秀玲，郝岗平，等.不同外植体和激素对银杏愈伤组织诱导和生长的影响［J］.山东师范大学学报：自然科学版，2008，23（1）：129-133.

［10］ 崔 刚，唐 蕾，王 武.培养基和外源激素对银杏愈伤组织诱导、生长及叶绿素含量的影响［J］.食品与生物技术学报，2008，27（2）：117-122.

［11］ 孟良玉，兰桃芳，卢佳琨，等.败酱草中黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性［J］.食品科学，2010，31（24）：214-217.

［12］ 李 敏.银杏叶总黄酮的提取及其抗氧化性的研究［J］.应用化工，2013，42（6）：1023-1032.

［13］ 胡蕙露，胡翠玲，杨枝发.银杏茎段组织培养正交试验［J］.安徽农业大学学报，1997，24（2）：25-29.

［14］ 王洪善，孙满芝，孔庆访，等.银杏愈伤组织培养形态建成的研究［J］.林业科技开发，1997（5）：36-38.

［15］ 朱红威，邵菊芳，李 庆，等.不同培养条件对银杏愈伤组织生长及黄酮含量的影响［J］.食品科学，2007，28（11）：102-105.

［16］ 哈斯其美格，曹 忻，李海玲，等.不同激素组合对唐古特大黄愈伤组织的影响［J］.中成药，2014，36（10）：2196-2198.

［17］ Carrier D J，Consentino G，Neufeld R，et al.Nutritional and hormonal requirements of Ginkgo biloba embryo-derived callus and suspension cell culture［J］.Plant Cell Rep，1990，8（11）：635-638.

［18］ 胡燕梅，张治华，周骏江，等.正交试验优化银杏胚愈伤组织继代培养及黄酮积累［J］.北方园艺，2009（12）：34-37.

R284

B

1001-1528（2015）12-2787-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.050

2015-03-06

陕西省科技厅自然科学专项计划项目 （2014K14-03-03）

胡选萍 （1975—），女，硕士，讲师，从事植物资源开发及生物技术研究。E-mail：pingxh2010@126.com