微孔板和分光光度计法检测7种食用菌的抗氧化活性

李根林， 李 竹， 吴宿慧， 李寒冰， 张颜语， 吕 宁， 韩素月， 王晨琳， 杨 阳

（河南中医学院药学院，河南郑州450008）

微孔板和分光光度计法检测7种食用菌的抗氧化活性

李根林， 李 竹， 吴宿慧*， 李寒冰， 张颜语， 吕 宁， 韩素月， 王晨琳， 杨 阳

（河南中医学院药学院，河南郑州450008）

目的 建立微量检测食用菌体外清除二苯代苦味酰基自由基 （DPPH·）活性的方法，并比较常见食用菌的抗氧化活性，为寻找天然抗氧化剂提供初步的筛选方法和技术资料。方法 超声提取得到香菇等7种食用菌和火麻仁的提取物后，采用微孔板与分光光度计法测定其DPPH·清除率，然后对这两种方法的测定结果进行曲线拟合，并对实验耗时、试剂用量和方法重复性方面进行对比，进而比较其DPPH·清除活性。结果 两种方法所得的DPPH·清除率无统计学差异，但在实验耗时、试剂用量等方面，微孔板法有明显优势。另外，食用菌水提物的抗氧化活性均明显高于醇提物，其中香菇水提物的活性最高。结论 微孔板法测定食用菌DPPH·的清除活性时具有准确、快捷、重复性好等特点，而且食用菇水溶性成分的抗氧化活性大于醇溶性成分，可为后续产品的开发提供技术资料。

食用菌；抗氧化活性；微孔板；分光光度计；DPPH·

自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，当体内代谢产物的自由基过多或清除能力下降时，会导致生物细胞氧化性损伤，引发心血管疾病、癌症等各种病变［1］，因此清除体内外过量自由基有着重要意义，而多种食用菌具有确切的体外抗氧化活性［2］。目前，分光光度计法［3］作为一种经典的抗氧化实验方法，广泛应用于药品和食品的检测，其简便易行［4-7］，但测试大规模样品时存在耗时长、有机溶剂消耗大等缺陷，因此建立一种快速、精确、低成本的抗氧化活性测定方法具有广阔的应用前景。本实验对分光光度计法进行改良，并以阳性对照品维生素E（VE）、具有DPPH·清除作用的火麻仁及香菇为研究对象，建立微孔板法对香菇等7种食用菌进行体外抗氧化活性测定，期冀为其活性初筛和相关机能食品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 样品购自河南省郑州市农贸市场，经河南中医学院陈随清教授鉴定，分别为真菌类担子菌纲伞菌目伞菌科香蕈Lentinus edodes（Berk.）Sing的子实体香菇、担子刚伞菌目侧耳科真菌糙皮侧耳Pleurotus ostreatus（Jacq.ex Fr.）Quel的子实体平菇、层菌纲伞菌目侧耳科真菌刺芹侧耳Pleurotus eryngii的子实体杏鲍菇、伞菌目白蘑科真菌冬菇Flammulina velutiper（Fr.）Sing的子实体金针菇、层菌纲伞菌目白蘑科真菌真姬菇Hypsizygusmarmoreus（Peck）H.E.Bigelow不同品种的子实体白玉菇、蟹味菇、海鲜菇。

火麻仁购自郑州本草国药馆，经河南中医学院陈随清教授鉴定，为桑科植物大麻Cannabissativa L的干燥成熟果实。

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·，批号STBC5116V，美国Sigma公司）；天然型维生素E胶丸 （批号20131008，青岛双鲸药业有限公司）。无水乙醇为分析纯 （批号20130630，天津市凯通化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器设备 96孔细胞培养板（美国Corning公司）；分析天平 （德国赛多利斯公司）；100～200目药材粉碎机 （北京中仪泓瑞科技发展有限公司）；Dragon移液器（北京智杰方远科技有限公司）；VIS-7220N可见分光光度计（北京瑞丽分析仪器有限公司）；Multiskan GO全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-250DE数控

超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-D循环真空泵 （巩义市英峪予华仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理 取食用菌适量，去除表面残留的培养基等杂质，洗净，60℃下干燥，粉碎，过60目筛，密封备用。另取火麻仁适量，去皮捣碎，过60目筛，密封备用。

1.3.2 DPPH·溶液的制备［8-9］精密称取DPPH·0.020 1 g，置于250 mL量瓶中，无水乙醇定容至250 mL，摇匀，即得0.2 mmol/L DPPH·溶液，4℃下避光保存，备用。

1.3.3 阳性对照品维生素E（VE）溶液的制备［8-9］取维生素E胶丸4粒 （每粒含VE 100 mg），剪破胶丸壳，加入无水乙醇5 mL溶解，摇匀，即得80 mg/mL VE溶液。

1.3.4 样品制备 称取食用菌干粉 （30.000±0.001）g两份，分别加入20倍量双蒸水和无水乙醇，超声提取25 min（25℃、20 kHz），抽滤，提取液浓缩至1 000 mg/mL，4℃下保存备用。火麻仁样品的制备方法与食用菌相同。

1.3.5 微孔板法 以VE、食用菌香菇水提物、火麻仁醇提物为受试品，每份设置3组，即对照组、样品组、空白组（消除样品背景色），分别加样于96孔细胞培养板中。其中，样品组加入0.5倍梯度稀释的不同浓度受试品溶液100μL和DPPH·溶液100μL，每孔反应体系200μL；空白组以等体积无水乙醇代替DPPH·溶液；对照组以等体积蒸馏水或无水乙醇代替受试品溶液，加样方法及加样量见表1。加样结束后，室温下避光反应30 min，酶标仪在517 nm波长下测定吸光度3次，取平均值，计算DPPH·的清除率。

表1 各组加样方法与加样量

1.3.6 分光光度计法［8-10］反应于10 mL离心管中进行，各试剂加样方法同 “1.3.5”项，但加样量均为3 mL，每管反应体系均为6 mL，室温下避光反应30 m in，然后可见分光光度计在517 nm波长下测定吸光度3次，取平均值，计算DPPH·的清除率。

1.3.7 测定方法拟合 对 “1.3.5”和 “1.3.6”项下两种方法所得的结果进行曲线拟合，并进行重复性实验以比较两者的RSD。

1.3.8 微孔板法测定食用菇的抗氧化活性 按 “1.3.5”项下方法，对7种食用菌提取物的DPPH·清除率进行测定。

1.3.9 计算方法 计算公式为DPPH·清除率=［Ac-（A-Aj）］/Ac×100%，Reed Muench法计算IC50，SPSS 19.0软件进行曲线拟合，Microsoft Excel 2010软件计算相对标准偏差 （RSD）。

2 结果

2.1 曲线拟合模型的建立 维生素E作为标准物质，分别以微孔板和分光光度计法所得清除率为因变量，受试品溶液浓度为自变量，建立曲线拟合模型，SPSS 19.0软件进行拟合，并加以比较。结果发现，对数模型的统计学意义优于其他模型，因此对对数模型参数进行描述。

在微孔板法的对数模型单因素方差分析（one-way ANOVA）中，F（1，4）=71.402，P＜0.001，对模型中系数和常数的统计学意义进行考察时发现，系数23.300的t= 8.450，P＜0.001，而常数22.441的t=4.702，P＜0.01，表明该模型具有显著的统计学意义，可用于实验分析。另外，模型的决定系数R=0.973，公式为y=23.3Ln（x）+22.441。

在分光光度计法的对数模型one-way ANOVA中，F（1，4）=79.981，P＜0.001，对模型中系数和常数的统计学意义进行考察时发现，系数23.895的t=8.943，P＜0.001，而常数20.768的t=4.491，P＜0.05，表明该模型具有显著的统计学意义，可用于实验分析。另外，模型的决定系数R=0.976，公式为y=23.895Ln（x）+20.768，见图1和表2。

图1 维生素E水提物微孔板法与分光光度计法的拟合曲线

表2 维生素E曲线拟合的方法学考察

为了验证模型的可行性，本实验选择抗氧化活性已知的火麻仁油 （标准受试品）及未知的香菇进行曲线拟合。结果表明，火麻仁醇提物微孔板法的模型公式为y= 22.425Ln（x）-43.828，分光光度计法的模型公式为y= 22.245Ln（x）-43.167；香菇水提物微孔板法的模型公式为y=19.182Ln（x）+31.168，分光光度计法的模型公式为y=20.139Ln（x）+30.049，而且均具有显著的统计学意义，见图2、图3、表3。

2.2 微孔板和分光光度计法的差异比较 微孔板和分光光度计法所得的3种受试品的DPPH·清除率量效关系拟合曲线的相似度较高，重叠率也很高，见图1～图3，可认为

两种方法的结果一致。另外，还对这两种方法在实验耗时、试剂用量和重复性方面进行比较，见表4，可知两种测定方法所得的IC50值相当；在实验耗时方面，微孔板法约40～45 min，而分光光度计法约55～60 min，但由于前者的反应体系在96孔板中进行，理论上可以一次测定96个样品，而后者一次只能测定一个样品，因此在大规模样品筛选时，微孔板法的测定效率将显著提高；在试剂用量方面，微孔板法只有分光光度计法的3.33%左右；在重复性实验中，各组样品间RSD值差异不大，说明这两种方法在多次测定同一样品时的结果变异小，重复性好。

图2 香菇水提物微孔板法与分光光度计法的拟合曲线

图3 火麻仁醇提物微孔板法与分光光度计法的拟合曲线

表3 曲线拟合的方法学考察

2.3 微孔板法测定7种食用菌水提物的体外抗氧化活性（图4） 由图可知，其半对数量效关系曲线均呈明显的“S”型，与阳性对照药VE的趋势相同。由此说明，它们均具有体外清除DPPH·的能力，而且香菇水提物的抗氧化活性明显高于其他食用菌。

表4 3种受试品微孔板与分光光度计法的相关指标对比（n=8）

图4 7种食用菌水提物抗氧化活性对比

2.4 微孔板法测定7种食用菌醇提物的体外抗氧化活性（图5） 由图可知，其半对数量效关系曲线也均呈明显的“S”型，与阳性对照药VE的趋势也相同。由此说明，醇提物也有一定的抗氧化活性。

图5 7种食用菌醇提物体外抗氧化活性对比

2.5 7种食用菌水提物和醇提物的体外抗氧化活性比较（表5） 由表可知，食用菌水提物的抗氧化活性依次为香菇＞平菇＞白玉菇＞杏鲍菇＞海鲜菇＞金针菇＞蟹味菇，而醇提物依次为白玉菇＞平菇＞香菇＞海鲜菇＞杏鲍菇＞金针菇＞蟹味菇。由此说明，香菇水提液 （2.81 mg/mL）的抗氧化活性最高，而且7种食用菌水提物的IC50值均明显低于醇提物，说明前者的体外抗氧化活性大于后者。

3 结果与讨论

本实验在传统分光光度计法测定体外抗氧化活性的基础上，建立了微孔板法筛选模型。结果发现，该方法与分光光度计法相比，具有操作简便、测试速度快、耗费试剂少、精确度高、重现性好等优点，并克服了传统方法操作费时、溶剂量大、成本高等不足，与文献 ［11］报道一致。因此，微孔板法适合大规模样品初筛，具有良好的实用性，尤其是对微量天然产物 （如食用菌等）抗氧化活性的测试。

表5 7种食用菌水提物和醇提物DPPH·清除率的IC50值（mg/m L）

另外，实验结果显示，7种食用菌水提物与醇提物的抗氧化活性有明显差异，水提物的抗氧化活性明显大于醇提物，并且香菇水提物的活性最高，这为寻找天然抗氧化剂提供了参考，也为香菇等食用菌的进一步开发和利用提供了技术依据。

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R284.1

B

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10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.046

2014-12-25

国家自然科学基金面上项目 （81473435）；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目 （2013GGJS-092）；河南省教育厅科学技术重点资助项目 （14A310023）；河南中医学院研究生创新基金项目 （2014YCX009）；河南中医学院药学院大学生创新学习项目 （YXCX［2014］22）

李根林 （1963—），男，教授，硕士生导师，从事中药生物活性评价研究。Tel：13703920231，E-mail：lhb9988@163.com

*通信作者：吴宿慧 （1980—），女，讲师，从事中药药理学研究。Tel：（0371）65962746，E-mail：iwusuhui@163.com