不同溶液体系中甘草酸的超滤分离规律研究

瞿其扬， 李存玉，2， 郑云枫， 时 浩， 彭国平，2*

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023）

不同溶液体系中甘草酸的超滤分离规律研究

瞿其扬1， 李存玉1，2， 郑云枫1， 时 浩1， 彭国平1，2*

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023）

目的 探讨不同溶液体系下甘草酸的超滤分离规律。方法 以甘草酸为实验对象，在不同溶剂、药液pH等条件下，选择系列截留分子量的超滤膜进行超滤，HPLC法计算甘草酸超滤前后的变化，分析不同条件下甘草酸存在状态与其超滤行为的相关性。结果 含有相同浓度甘草酸的单体溶液与甘草提取液在相同条件下，超滤透过率具有明显差异。此外，在酸性条件下甘草酸透过率降低，而在碱性条件下增加。在不同体积分数乙醇溶液中，甘草酸透过率随乙醇体积分数升高而有不同程度增加。结论 不同溶液体系下甘草酸的存在状态决定了其超滤透过行为，为超滤技术应用于中药制剂领域提供一定参考。

甘草酸；超滤；溶液体系；HPLC

超滤是一种以孔径截留为特征的分离模式，依靠一定的压力和体积流量，通过膜孔的筛分作用，迫使大分子物质留下，小分子物质透过［1］，具有操作简单、能耗低、工艺流程短等优点，在中药制药领域具有较大的开发潜力，尤其是中药注射剂方面。但在实际应用时，成分的分离规律与超滤膜截留分子量常出现相关性差的现象，仅依靠孔径筛分理论往往无法解释多样性的超滤结果［2-3］，从而阻碍了超滤技术的推广应用，目前多归结为溶液中的黏度、介电常数等因素引起［4-5］，而忽略同一成分在不同溶液环境中的存在状态与其超滤行为的相关性。

由于中药制剂中成分的多样性，导致在同一溶液体系中，不同的成分均受到这一复杂环境的影响，会出现游离、解离、缔合等形式［6-7］。由于成分存在形式的差异，其原本所具有的物化性质也会发生相应的改变，在进行超滤时也会产生相应的影响。因此，为了明确成分的超滤分离行为，首先需要制备不同的溶液体系，结合成分透过行为总结规律，进而指导超滤技术的应用。

本实验选择具有酸性、表面活性且在中药制剂中较为常见的指标成分甘草酸作为实验对象，HPLC法分析超滤前后溶液中甘草酸的含有量，研究不同溶液体系下甘草酸透过率的变化，分析溶液环境-透过行为-存在状态的相关性，为中药超滤分离原理研究提供一定的参考。

1 仪器和材料

1.1 实验仪器 Minipore Pellicon 2板框式超滤装置、Minipore蠕动泵、超滤膜 （再生纤维素，截留分子质量100、30、10、5、1 kDa） （美国Minipore公司）；Waters 2695 HPLC色谱仪（美国Waters公司）；AEL-40SM型电子天平 （十万分之一，梅特勒-托利多上海有限公司）；PB-10型pH计 （德国赛多利斯公司）；FA2204型电子天平 （万分之一，上海市安亭电子仪器厂）；H66025超声清洗机（无锡市兰辉超声电子设备厂）。

1.2 材料 甘草酸提取物 （纯度＞95%，南京泽朗医药科技有限公司，批号20120405）；甘草酸对照品 （中国食品药品检定研究院，批号110731-200614，供含有量测定用）。甲醇、乙腈为色谱纯；三氟乙酸为分析纯；水为纯化水。

甘草饮片 （亳州市中正中药材饮片有限公司，批号1305201），经南京中医药大学吴启南教授鉴定为豆科植物乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，符合 《中国药典》2010版 （一部）有关项下的规定。

2 方法

2.1 供试品配制

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的甘草酸对照品适量，置于量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得质量浓度为0.561 8 mg/mL的甘草酸对照品溶液。

2.1.2 超滤原液的制备及预处理

2.1.2.1 甘草酸溶液 称取甘草酸提取物适量，加水配制成质量浓度为1.0 mg/mL的药液，超声10 min，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2.2 甘草提取液［8-9］称取甘草药材160.0 g，分别加10、8倍体积水回流，提取2.0、1.5 h，合并提取液，浓缩1.2倍后离心，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2.3 甘草混合液 取甘草酸溶液和甘草提取液，等体积混合，超声10 min，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2.4 不同pH甘草酸溶液 称取甘草酸提取物适量，加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制成质量浓度为1.0 mg/mL的药液，pH值为3.0、9.0，超声10 m in，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2.5 不同体积分数乙醇甘草酸溶液 称取甘草酸提取物适量，用10%、20%乙醇配制成质量浓度为1.0 mg/mL的药液，超声10 min，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2 色谱条件［10-11］Thermo Scientific C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；乙腈为流动相A，0.1%三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱，顺序见表1；体积流量1 mL/min；检测波长254 nm；进样量10μL；柱温30℃。

表1 梯度洗脱顺序

2.3 超滤实验

2.3.1 甘草酸超滤平衡实验 取甘草酸溶液10 L，分别选择100、30、10、5、1 kDa超滤膜进行超滤，操作温度25℃，操作压力2 psi（1 psi=6.89 kPa），将超滤装置中进液端、截留液端及滤前原液端放于同一容器内。当超滤液端通量为原液体积的0.5、1、2、4、6倍体积时，取容器内平衡液及超滤液，将不同平衡体积后的样品进行HPLC检测，并按式 （1）计算甘草酸吸附率。

其中，R为成分的吸附率；C平衡为平衡液中甘草酸质量浓度，单位为mg/mL；C原液为原液中甘草酸质量浓度，单位为mg/m L。

2.3.2 甘草酸超滤实验 超滤平衡实验后，分别将甘草酸溶液、甘草提取液、甘草混合液、不同pH甘草酸溶液、不同体积分数乙醇甘草酸溶液置于超滤系统中，采用系列孔径超滤膜超滤，待充分平衡后取样，进而收集超滤液。超滤后，将超滤液端混匀，取样，HPLC检测超滤液、平衡液，根据式 （2）计算成分透过率T。

3 结果与分析

3.1 超滤规范操作 由图1可知，10、30、100 kDa超滤膜平衡2～4倍溶液体积后，甘草酸吸附率较为稳定，5和1 kDa超滤膜在平衡1～2倍体积后亦然。由于5和1 kDa

超滤膜通量较小，平衡1倍溶液体积所需时间较长，故根据吸附率总体趋势变化，选择平衡2倍溶液体积后取样，结果相对稳定，而且时间较为合适。

图1 不同平衡体积下超滤膜对甘草酸的吸附率

3.2 不同溶液体系对甘草酸透过率的影响

3.2.1 甘草酸溶液、甘草提取液和混合液 三种溶液中，甘草酸透过率均随膜孔径增大而升高，其中甘草提取液与混合液中成分的透过率相当。超滤膜在30 kDa以下时，提取液、混合液中甘草酸透过率均高于甘草酸单体溶液，见表2。

表2 不同药液中甘草酸的透过率 （n=3）

3.2.2 不同pH值甘草酸溶液 甘草酸溶液pH约为5.3～5.5。随着溶液pH降低，透过率呈明显下降趋势；溶液pH升高，透过率则随之上升，见表3。

表3 不同溶液pH下甘草酸的透过率（n=3）

3.2.3 不同体积分数乙醇的甘草酸溶液 乙醇使溶液中甘草酸透过率明显高于单体水溶液。而且随着乙醇体积分数升高，甘草酸透过率有一定程度的上升，见表4。

表4 不同体积分数乙醇溶液中甘草酸的透过率 （n=3）

4 讨论

4.1 超滤操作方法是影响实验结果的关键因素之一，但现有文献中鲜有关于超滤规范操作的报道，为避免操作等原因引起的结果多样化，需要对超滤的取样方法进行系统性研究。本实验选取2倍平衡体积后取样，避免因超滤膜对成分吸附变化而导致数据不稳，从而确保后续实验结果的准确性。

4.2 甘草提取液、混合液与相同质量浓度甘草酸的单体透过率存在明显差异，表明不同溶液体系对甘草酸超滤行为具有显著影响。由于甘草酸属于皂苷成分，在水溶液中易形成 “胶束”，阻碍其透过超滤膜［3］，在提取液中形成单分子盐［12］而易于透过，说明溶液制备方式影响了成分存在形式，继而影响其透过。而将两种甘草酸溶液混合制备混合溶液进行超滤时，甘草酸透过率并非介于两者之间，而是较接近甘草提取液，这也说明混合溶液体系对甘草酸单体的超滤行为产生一定影响。

4.3 超滤法对不同溶液体系中甘草酸单体透过率的影响各异，可能与甘草酸具有表面活性有一定关联。甘草酸亲水端含有羧基结构，在酸性条件下其解离受到抑制，与水分子亲和力减小，有助于分子间形成胶束而被截留；碱性条件下其以离子形式存在，分子间排斥增大，致使分子团聚作用减弱［13-14］，从而改变甘草酸单体的超滤效果。而在溶液中加入大量有机醇时，会抑制甘草酸胶束的形成［14］，并改善其疏水端的亲水性，因此破坏了该分子团聚的溶液条件，使甘草酸单体的透过率得到显著提高。

4.3 综上所述，不同溶液体系下成分的存在状态有一定差异，使其透过行为发生改变，最终导致成分透过率的变化。因此，当中药成分进行超滤时，可以通过筛选相应溶液环境来改变成分透过率，以达到分离的目的，对超滤技术的推广应用有一定借鉴意义。但是，成分存在形式影响超滤行为的变化机制尚未明确，仍有待作进一步分析研究。

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R284

B

1001-1528（2015）12-2775-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.047

2014-11-24

国家自然科学基金 （81373980，81503258）；江苏省自然科学基金青年基金 （BK20151005）

瞿其扬 （1990—），男，硕士，研究方向为中药化学与分析。Tel：18351895393，E-mail：18351895393@163.com

*通信作者：彭国平 （1963—），男，研究员，博士生导师，研究方向为中药成分分离精制及新药研究。Tel： （025）86798186，E-mail：guopingpeng@sohu.com