吉林省猪源沙门菌毒力基因检测及耐药性分析

陈 龙，李茂辉，康元环，曹 亮，单晓枫，王姣姣，钱爱东

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

吉林省猪源沙门菌毒力基因检测及耐药性分析

陈 龙，李茂辉，康元环，曹 亮，单晓枫，王姣姣，钱爱东

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

为了解吉林省规模化猪场猪群中沙门菌的携带、毒力基因分布及耐药性等情况，本试验于2013年间采集吉林省规模化猪场猪直肠拭子540份，经细菌分离、生化鉴定、分子生物学鉴定，共检出猪源沙门菌18株，检出率3.33%，同时对菌株进行药敏试验、毒力基因检测及致病性试验。结果显示，18株分离株对链霉素耐药率为72.22%，对四环素耐药率为72.22%，其他药物耐药率普遍高于22.2%，且多重耐药严重。此外，共检测10种毒力基因，其中sse C、spv A、spv R三种基因检出率分别为72.2%、72.2%、83.3%。小鼠致病性试验中，有11株分离株对小鼠具有较强的致病性（61.1%）。表明分离沙门菌存在多重耐药现象，且致病力的增强可能与毒力岛和毒力质粒的存在有关。

猪；沙门菌；药敏试验；毒力基因

沙门菌（Salmonella）是引发人和动物食物中毒、胃肠炎的重要的人畜共患病原菌，其在临床上较为常见，治疗时，常常盲目的使用抗生素，导致多重耐药菌株的出现。此外，该菌还具有多种毒力基因，主要存在于质粒和染色体上的毒力岛中[1]，沙门菌粘附到宿主组织后通过毒力因子侵袭宿主细胞，导致宿主患病及死亡[2]，因此，猪源沙门菌的流行情况值得重视。目前，我国多个省市已开展了猪源沙门菌携带的调查与研究，但是却未见吉林省的报道。本研究采用直肠棉拭子对吉林省部分规模化养猪场健康猪沙门菌进行分离，用常规理化及PCR方法对其进行鉴定，并对耐药性以及主要毒力基因进行分析，为猪源沙门菌病的预防、诊断和治疗提供科学的试验数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TTB增菌液、SC增菌液、BS琼脂、H.E.琼脂、三糖铁（TSI）琼脂，购自青岛海博生

物技术有限公司；生化发酵管、革兰染色液、药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；DNA Marker DL-2 000、Taq DNA聚合酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒，购自北京索莱宝技术有限公司等

1.2 细菌分离纯化 病料来源为2013年3月-2013年8月，选取吉林省长春、松原、四平、辽源、吉林等地区的规模化猪场，采集临床健康猪直肠棉拭子，共计540份。按照食品安全国家标准GB 4789.4-2010进行初步分离沙门菌，将疑似沙门菌的菌落进行纯培养，并于4℃保存。

1.3 细菌鉴定

1.3.1 细菌的理化鉴定 将纯化的细菌分别进行TSI琼脂鉴别培养、赖氨酸脱羧酶试验、吲哚试验、KCN抑制试验、尿素酶试验、糖发酵试验（甘露醇、山梨醇、卫矛醇、水杨苷）、ONPG试验、丙二酸盐利用试验，具体操作过程与结果判定参见国标GB 4789.4-2010与农业部行标NY/T 550-2002。

1.3.2 细菌的PCR鉴定 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，根据沙门菌invA基因设计引物：inv A-F 5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′、inv A-R 5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′，引物合成由华大基因生物工程技术服务公司合成。反应条件为：95℃5 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，30个循环；72℃10min；4℃终止反应、保存。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，序列结果用NCBI-BLAST搜索比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

1.3.3 细菌血清型鉴定 采用玻板凝集法，利用A～F多价O血清及单因子O血清鉴定菌株的O抗原，H因子血清鉴定其鞭毛抗原，并判定沙门菌种属。

1.4 药敏试验 采用CLSI推荐的K-B法进行，根据CLSI（2009）的标准判定其耐药性。质控菌采用大肠埃希菌ATCC25922。

1.5 毒力基因检测 对猪源沙门菌进行10种常见的毒力基因的PCR检测,引物序列见表1。

沙门菌质粒毒力基因spv A、spv C、spv R检测引物参考GenBank，沙门菌毒力岛基因M gt C、org A、ssc A、sse C、sse D、sse E、ar A、bcf的检测引物参考文献[3-4]。采用煮沸法提取细菌总DNA模本。PCR反应体系为25μL。反应条件经优化：95℃5min；94℃1min、退火1min（spv C，spv R为54℃，ssc A、sse E、ar A、bcf为55℃，sse C、sse D为58℃，spv A、M gtC、o rg A为59℃），72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表1 PCR扩增引物序列

1.6 致病性试验 将鉴定的猪源沙门菌腹腔注射接种健康昆明系小鼠0.2 mL（108CFU/mL），试验前禁食、禁水24 h，每株菌设5个重复，对照组腹腔注射生理盐水，隔笼饲养，连续观察7 d，观察并剖检发病后死亡的小鼠，按1.3方法对其进行细菌分离鉴定，并统计致病率。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定 540份临床健康猪直肠棉拭子，通过沙门菌增菌液和沙门菌鉴别培养基、生化发酵管、PCR特异性基因inv A扩增鉴定，证明18株细菌分离菌株为沙门菌，占采样总数的3.33%（18/540）。18株沙门菌经血清学鉴定，其中猪霍乱沙门菌有9株、鼠伤寒沙门菌6株、德尔卑沙门菌2株、剑桥沙门菌1株。

2.2 药敏试验结果 18株猪源沙门菌对14种抗生素的药敏结果见表2。耐药频率显示，猪源沙门菌分离株至少为4重耐药、最多为12重耐药、其余为5重耐药至11重耐药均有菌株分布。

2.3 毒力基因检测结果 对18株猪源沙门菌进行10种毒力基因的PCR检测，所有毒力基因均有检出。其中分布于毒力岛2上的毒力基因sse C（72.2%），毒力质粒上的毒力基因spv R（83.3%）、spv A（72.2%）、spv C（72.2%），远高于其他毒力岛上的毒力基因，如org A（22.2%）、M gt C（22.2%）、bcf A（11.1%）、ara B（16.7%）、sse D（50%）、sse E（33.3%）。

表2 18株猪源沙门菌药敏结果

2.4 致病性试验结果 将18株猪源沙门菌分离株接种小鼠，试验结果显示，多数分离株对小鼠具有较强的致病性，其中11株具有致病性（61.1%）；有6株呈现不同程度的发病后死亡，致死率为33.3%。从致死小鼠体内实质器官分离出的细菌、经理化及分子生物学鉴定、与接种细菌相同；而对照组小鼠则无异常。

3 讨论

猪源沙门菌是典型的人兽共患病原菌。本试验对吉林省部分地区的规模化养猪场临床健康猪群沙门菌的携带情况进行了调查，共分离出疑似沙门菌35株，进一步采用沙门菌种特异性引物invA进行验证，最终鉴定出沙门菌18株，分离率为3.33%。

本试验对18株猪源沙门菌吉林分离株进行了14种抗生素的耐药性分析，结果显示，这些菌株对四环素（88.89%）、链霉素（72.22%）、多西环素（55.56%），均超过50%。与我国其他省份相比，吉林省猪源沙门菌对不同抗生素的耐药情况不尽相同，这与抗生素使用情况和细菌分离株地区差异有关[5]。虽然吉林省猪源沙门菌分离株对大部分抗生素表现出较高的敏感性，但考虑中度敏感率明显高于其他省市，因此，在选择药物治疗沙门菌引发的疾病时，要慎用少用这类抗生素。

致病性试验结果证明，多数猪源沙门菌分离株对小鼠具有致病性。此外，猪源沙门菌的致病性与毒力基因关系密切。本研究对18株猪源沙门菌进行了10种毒力基因的PCR检测。结果表明，从18株猪源沙门菌中检测到13株具有sse C基因，且对小鼠的致病性较高。这可能与sse C基因编码的sse C蛋白作为Ⅲ型分泌系统中底物蛋白的效应蛋白，且SPI2编码与系统感染有关的Ⅲ型分泌系统。在致病性的试验中，携带较多毒力岛2上的毒力基因其致病性显著高于没有此基因的菌株；此外，在只检测出毒力质粒的分离株中，小鼠致病率很高，表明spv的存在能增强菌株的致病力；毒力岛和毒力基因同时存在时，引起的病变更为严重。相关文献表明，SPI1编码与侵袭力有关的Ⅲ型分泌系统、SPI3参与沙门菌在巨噬细胞内存活有关、SPI4和SPI5编码参与细菌在靶细胞内的相关蛋白等[6]，然而这些毒力岛上的毒力基因org A、M gt C、bcf A、ara B检出率较低，无法确切说明这些毒力基因与致病性的关系，因此，尚待进一步的研究。

[1]陈金顶，索青利，廖明，等.沙门菌的inv A基因序列分析与分子检测[J].中国人兽共患病杂志，2004，20（10）：868-871.

[2]王效义.沙门菌毒力岛及其Ⅲ型分泌系统[J].生物技术通讯，2004，15（2）：160-162.

[3]Bhowmick P P，Devegowda D，Ruwandeepika H A，et al.Pres⁃ence of Salmonella pathogenicity island 2 genes in seafood-associ⁃ated Salmonella serovars and the role of the sseC gene in survival of Salmonella enterica serovar Weltevreden in epithelial cells[J]. Microbiology，2011，157（Pt1）：160-168.

[4]田质高.蛋源沙门菌毒力岛的检测及标志基因的研究[D].扬州：扬州大学，2009：28-30.

[5]杨宝伟.陕西食源性沙门菌耐药及相关基因[J].微生物学报，2010，50（6）：788-796.

[6]Gerlach R G，Clfiudio N，Rohde M，et al.Cooperation of Salmo⁃nella pathogenicity islands 1 and 4 is required to breach epitheli⁃al barriers[J].Cell Microbiol，2008，10（11）：2364-2376.

Virulence gene detection and antibiotic sensitivity of sw ine Salmonella from Jilin province

CHEN Long，LIMao-hui，KANG Yuan-huan，CAO Liang，SHAN Xiao-feng，WANG Jiao-jiao，QIAN Ai-dong
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

To investigate the virulence genes and antibiotic susceptibility of swine Salmonella in Jilin Province，a total of 540 rectal swabs sampleswere collected from health pigs in scale farms in 2013 and 18 isolates of Salmonellawere isolated which were identified bymorphology，physical and chemical characteristics，susceptibility testing,virulence genes detection and pathogenicity. The results showed that the resistance rateswere 72.22%to the drugs of STR and TET，respectively.Other resistance rates were generally higher than 22.2%，and most of the Salmonella isolates weremulti-drug resistance.In addition，the positive rates of the virulence genes of sseC，spvA and spvR were 72.2%，72.2%and 83.3%，respectively.Moreover，11 isolates were proved to be pathogenic tomice（61.6%）.The Salmonella isolated showedmultiple-resistance to Antimicrobial Drugs.The increase of pathoge⁃nicitymay relate to the plasmid virulence and some pathogenicity island.

Swine；Salmonella；susceptibility testing；virulence genes Corresponding authors：QIAN Ai-dong；SHAN Xiao-feng

S856.65+1

A

0529-6005（2015）11-0082-03

2014-04-04

吉林省现代农业产业技术体系建设-生猪产业技术体系项目（201224、201324）

陈龙（1989-），男，博士生，研究方向为动物细菌学，E-mail：944515582@qq.com

钱爱东，E-mail：qianaidong0115@163.com；单晓枫，E-mail：sxf1997@163.com