副鸡禽杆菌的分离鉴定

李淑芳，龚玉梅，王宏俊，张培君

（1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 海淀 100097；2.北京大北农科技集团股份有限公司，北京 海淀 100195）

副鸡禽杆菌的分离鉴定

李淑芳1，2，龚玉梅1，王宏俊1，张培君1

（1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 海淀 100097；2.北京大北农科技集团股份有限公司，北京 海淀 100195）

副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum）是鸡传染性鼻炎的病原菌。早在1920年，Beach首先报道鸡传染性鼻炎，1932年De Blieck就首次分离到该菌，并将其命名为鸡嗜血红蛋白鼻炎芽孢杆菌，在后来的很长一段时间内都称之为副鸡嗜血杆菌。Blaclall于2005年又将其重新命名为副鸡禽杆菌[1]。本病的发病特点是潜伏期短、传播迅速，短时间内便可波及全群。育成鸡表现为生长不良或迟缓，产蛋鸡产蛋量明显下降，处在产蛋高峰期的鸡群产蛋会下降10%～40%[1]，甚至停产，混合感染时可引起死亡，给养殖户造成较严重经济损失。

2014年6月，本实验室收到北京某公司鸡场的7只31日龄病鸡（其中2只死亡），具有典型鸡传染性鼻炎的临床症状，未经药物治疗。我们对病鸡进行细菌分离鉴定，具体报告如下。

1 材料与方法

1.1 病鸡 来源于北京某公司鸡场，具有典型的鸡传染性鼻炎的临床症状，主要特点为面部单侧或双侧肿胀、流鼻涕。

1.2 培养基 胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）为BD公司产品，购自北京欣经科生物试剂公司：TSA或TSB培养基在使用前均加入终浓度为50 μg/mL的NAD和10%的新生牛血清。

1.3 引物合成 参照陈小玲[2]的方法，将已知的Apg保守性片段引物序列，由生工北京分公司合成。上游引物：5′-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3′；下游引物：5′-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3′。

1.4 A、B、C型副鸡禽杆菌阳性血清，由澳大利亚昆士兰大学Pat Blackall教授惠赠。

1.5 菌株分离 无菌条件下处理送检病例的鸡头，用烧红的刀片烧烙眶下窦外表，无菌刀片切开眶下窦，然后用高压后的棉拭子取眶下窦分泌物，接种于TSA培养基上，37℃5%CO2温箱内培养24 h，挑选单个可疑菌落继续传代进行纯化培养至长出均一的菌落。

1.6 染色镜检 挑取单个菌落进行革兰染色，在光学显微镜下观察细菌的染色和形态特征。

1.7 卫星现象 接种环沾取液体培养物在血平板上密布划横线，再用产NAD的表皮葡萄球菌垂直划一竖线，37℃5%CO2培养20 h，观察细菌是否具有“卫星现象”。

1.8 回鸡试验 挑取单菌落接种TSB液体培养基中，37℃培养18 h，取新鲜培养物0.2mL，每个分离株眶下窦接种2只40日龄SPF鸡，接种后逐日观察其临床表现。

1.9 PCR鉴定 将上述新鲜TSB液体培养物取2 μL作模板，参照陈小玲等[2]的方法做PCR鉴定，同时将PCR产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，然后将测序结果同Gen⁃Bank中的相应序列进行比对。

1.10 分离株的血清学鉴定 （1）血清平板凝集试验：把分离株培养后制备抗原，在载玻片上加50 μL抗原，然后按照标准方法分别加50μL A、B、C阳性血清，同时设抗原对照、阴性、阳性血清对照，加样后捏住玻片两端轻柔地顺时针旋转，使抗原与血清充分混合，3～5 min出现凝集者为阳性，反之为阴性；（2）HI试验鉴定血清型：参照Page程序鉴定分离株的血清型[3]。抗原的制备：37℃5%CO2在TSA培养基上培养18 h后，用2mL的TSB肉汤洗下，8 000 r/min离心5min，弃上清后再用2 mL PBS重悬，洗3遍后，沉淀用1mL PBS重悬，在4℃放置3～7 d，即为Page程序所需抗原。用此抗原按照Blackall的方法进行HA和HI试验[3]（HI试验所用标准阳性血清分别作200、400、800倍稀释）。

2 结果

2.1 细菌分离及初步鉴定 从7只可疑病鸡的眶下窦内共获得6个分离株，经过传代纯化培养，在含有NAD和牛血清的TSA固体培养基上，观察到半透明露滴样的针尖样小菌落，且在普通琼脂培养基上不生长。过氧化氢酶试验结果均为阴性，挑取可疑菌落进行革兰染色，镜下可观察到均为革兰阴性短杆菌。

2.2 卫星现象 在血平板上6个分离株均呈现典型的卫星现象：在葡萄球菌附近生长的菌落较大且旺盛，离的越远菌落越稀疏且越小。

2.3 PCR结果 6个分离株和标准株均在500 bp位置处出现了DNA条带，同时阴性对照成立（图1），PCR产物测序结果经BLAST比对与Apg同源性高达98%。

图1 PCR结果M：Marker（DL 2 000）；1～6：分离株的PCR扩增结果

2.4 回鸡试验 用分离菌株人工感染的12只SPF鸡在24 h后都出现精神委靡、眶下窦及面部肿胀、流鼻涕等典型的鸡传染性鼻炎的症状，且在感染鸡的眶下窦又重新分离到纯的副鸡禽杆菌菌落。

2.5 血清型鉴定 Page程序对所有分离株的血清型鉴定结果一致，见表1。结果判定该分离株为B型。分离株与A型C型200～800倍稀释的标准阳性血清均为HI阴性，而与B型标准阳性血清800倍稀释后仍出现阳性[4]。

3 小结

本试验中的所有分离株革兰染色为阴性短杆菌；将分离株人工感染SPF鸡24 h后均出现面部严重肿胀、精神委靡、食欲减退、鼻腔有黏液流出等典型的鸡传染性鼻炎的临床症状，同时在发病鸡的眶下窦又重新分离到该菌；PCR鉴定结果为阳性且测序比对结果证实和副鸡禽杆菌的同源性极高；在含有NAD和牛血清的TSA固体培养基上呈针尖大小的露滴状生长，而在普通培养基中不生长；因为副鸡禽杆菌的生长依赖V因子，本试验中把分离株与葡萄球菌交叉接种于血平板上，利用葡萄球菌产生的V因子促进副鸡禽杆菌生长，此种现象被称为“卫星现象”，该特征可视为该菌鉴定的重要依据[1]。本试验中的鉴定结果可以判定分离株均为副鸡禽杆菌。当下实验室最通用的Apg血清学分型方法仍是Page方案[5]，参考传统的方法通过血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验鉴定其血清型，本试验结果显示，所有的分离株均为我国普遍流行的B型。

表1 Page方法的HI分型结果

目前，关于副鸡禽杆菌分离株的报道大都集中在育成鸡群和产蛋鸡群中[6-7]，本试验中的6个分离株都是从31日龄的雏鸡中分离得到的，且发病日龄在24日龄。针对4周龄内雏鸡暴发鸡传染性鼻炎在我国还是第1次，说明我国鸡传染性鼻炎的流行可能已经出现新的特点，在疾病预防和控制中应加以注意。

[1]Saif Y M.苏敬良，高福，索勋，译.禽病学[M].12版.北京：中国农业出版社，2012：930-940.

[2]Chen X，Mifilin J k，Zhang P，et al.Development and app lication of DNA probes and PCR tests for Haemophilus Paragallinarum[J]. Avian Dis，1996，40：398-407.

[3]Blackall P J，Eves L E，AUSG.Serotrping of Haemophilus para⁃gallinarum by the page scheme：com-Parison ofthe use of aggluti⁃nation and hemagglutination inhibition tests[J].Avian Dis，1990，34：643-645.

[4]苗立中，沈志强，王艳，等.蛋鸡传染性鼻炎病原的分离鉴定[J].中国家禽，2007，29（9）：19-21.

[5]Page L A.Haemophilus infection in chickens I.Characteristics of 12 Haemophilus isolates recovered from diseased chickens[J].Am JVetRes，1962，23：85-95.

[6]张培君，苗得园，龚玉梅，等.B型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2003，25（1）：56-58.

[7]路迎迎，路明华，陈小玲，等.B型副鸡禽杆菌安徽株的分离与鉴定[J].动物医学进展，2014，35（1）：122-125.

S858.31

B

0529-6005（2015）11-0058-02

2015-01-29

公益性行业（农业）科研专项-家禽主要细菌病防控技术研究与示范（201303044）

李淑芳（1987-），女，硕士，研究方向为预防兽医学，E-mail：lishufang0915@163.com

龚玉梅，E-mail：gongyumei1961@163.com