2012-2014年我国南方地区猪流行性腹泻病毒遗传进化分析

苏丹萍，李 冰，，张显浩，陈瑞爱，，蔡佳跃，贺东生，

（1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.广东大华农动物保健品股份有限公司，广东 云浮 527400）

2012-2014年我国南方地区猪流行性腹泻病毒遗传进化分析

苏丹萍1，李 冰1，2，张显浩2，陈瑞爱1，2，蔡佳跃2，贺东生1，2

（1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.广东大华农动物保健品股份有限公司，广东 云浮 527400）

为分析猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况，本试验对2012-2014年我国南方地区7个省市17份PEDV阳性样品的S基因主要的中和表位区（COE）序列进行了RT-PCR扩增、克隆和测序，并与国内外的代表性毒株进行序列比对和遗传进化分析，结果表明，本研究中的17株PEDV毒株COE中有16株属于第Ⅰ大群，而GD/FSss/2014属于第Ⅱ大群，所有COE的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.9%～99.8%和88.6%～100%，它们与经典毒株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%～99.5%和90%～98.6%，与疫苗株CV777 Vaccine的核苷酸和氨基酸同源性分别为95%～97.1%和92.9%～97.9%。COE的氨基酸序列发生了不同程度的点突变，为PEDV遗传进化分析和疫病防制提供了新的参考。

猪流行性腹泻病毒；主要中和表位区；南部地区；遗传进化

PEDV主要基因编码4种结构蛋白：S基因编

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）

码纤突蛋白（Spike，S）、E基因编码小包膜蛋白（Envelop，E）、M基因编码膜蛋白（Membrane，M）、N基因编码核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）[4]。其中S蛋白位于病毒粒子表面，在病毒粒子与细胞表面受体结合、膜融合和诱导宿主产生中和抗体等方面发挥重要生物学作用[5]。Chang SH等根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因的中和表位区鉴定出PEDV S基因的一个中和表位区（Core neu⁃tralizing epitope，COE，aa499-aa638）[6]。有研究表明，S基因在分析PEDV流行毒株的遗传变异和流行情况中发挥重要作用，而对PEDV COE的变异分析更能反应病毒免疫原性的变化情况[7]。本试验对我国南方地区2012-2014年采集并鉴定的17株PEDV的COE进行了克隆、测序，并对其遗传变异情况进行分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集 采集2012-2014年间广东、四川、浙江等7个省的不同的暴发严重腹泻的疑似感染PEDV猪场的仔猪的小肠或粪便样品，总共17份样品。

1.2 试剂材料 总RNA抽提试剂盒为Axygen公司产品，PrimerScriptOne Step RT-PCR Kit、pMD-19T克隆载体为TaKaRa（大连）公司产品；凝胶回收试剂盒为Omega公司产品。

1.3 样品中PEDV的RT-PCR检测 病料样品经处理后，提取其总RNA，具体操作按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit说明书进行。以抽提的RNA为模板，利用PrimerScript One Step RT-PCR Kit II进行RT-PCR检测，确定PEDV阳性样品。检测和测序用引物和反应程序参照田野等文献中的方法进行[8]。

1.4 PEDV COE的克隆与测序 以PEDV阳性RNA样品为模板对COE序列进行RT-PCR扩增。凝胶回收PCR产物，纯化后的PCR产物与pMD-19T载体连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，阳性重组菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，将所测序列上传GenBank序列库。

1.5 遗传进化分析 利用DNAStar和BioEdit软件将17株PEDV COE测序结果进行序列比对；利用Clustalx1.8和MEGA 4.0对这17个序列与国内外已发表的22株PEDV进行同源性比较（见表1），并进行遗传进化分析。

2 结果

2.1 PEDV S基因COE序列分析 将RT-PCR扩增所得的17个PEDV COE进行测序分析，所有17个COE序列全长为420个核苷酸，编码140个氨基酸。

表1 本试验中所用到的序列

把17个COE与国内外PEDV参考毒株进行同源性分析，本试验中17个COE核苷酸序列之间的同源性为92.9%～99.8%，推导的氨基酸序列之间的同源性为88.6%～100%；与经典毒株CV777株的核苷酸同源性为93.3%～99.5%，氨基酸的同源性为90%～98.6%；与CV777Vaccine株的核苷酸同源性为95%～

97.1%，氨基酸的同源性为92.9%～97.9%。与CV777 Vaccine株相比，17个COE氨基酸出现了以下一些主要的氨基酸点突变：L3→S3，A19→S19，T51→S51，K65→N65，G96→S96，G111→V111，Q135→E135；此外，其余个别毒株在5、22、23、25、29、68、69、80、93、101、107、110、114、122、123、137等点位发生氨基酸点突变，结果详见图1。

图1 COE氨基酸序列比对

图2 PEDV COE序列的遗传进化树

2.2 PEDV S基因COE序列遗传进化分析 将所测得的17个毒株序列与国内外已发表的23株PEDV的COE序列进行比较，并建立了遗传进化树。结果表明，39个COE可分为3个群：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其中有16个COE基因与BJ-2011-1、NPLPEDv、CV777 Vaccine、Attenuated DR13等属于第Ⅰ群，GD/FSss/2014与CV777、DR13等属于第Ⅱ群，KNU-0801、Chinju99属于第Ⅲ群。

3 讨论

2010年10月以来，PED已在全国各猪场普遍流行，并主要侵害7日龄以内的哺乳仔猪，发病率和死亡率高达60%～100%；该病夏季高温时也有发生与流行，已无明显的季节性，并且反复发作，给我国的养猪业造成了极大的损害。2013年以来，美国也发生了类似的PED疫情，造成严重的经济损失[9]。

PEDV S基因编码的S蛋白是该病毒的主要结构蛋白，在病毒感染宿主机体后介导中和抗体产生的过程中发挥重要的生物学功能，在免疫反应中起重要作用。COE是S基因中能够诱导产生中和抗体的主要抗原表位区，有研究表明，运用

COE分析PEDV流行毒株的流行趋势、抗原性的变异和遗传变异情况与运用S基因有很高的相似性，但具有省时、省力和节省开支等优点[10]。

本试验中，2012-2014年上半年间，我们采集了我国南部地区7个省市不同的暴发严重腹泻的疑似感染PEDV猪场的仔猪的小肠或粪便样品17份，经RT-PCR及测序鉴定确定均感染PEDV，并对S基因COE序列进行序列和遗传进化分析，对PEDV的流行病学和抗原性的深入研究提供参考。有研究表明，PEDV的COE是高度保守的[6]，而本研究中的17株PEDV COE序列与CV777 Vac⁃cine比对结果表明，这些毒株COE的氨基酸序列发生了不同程度的点突变现象，点突变的数目在3～10个之间，这些点突变是否会影响到病毒的抗原特性，是否会导致差的交叉保护，还有待于进一步的研究。

根据PEDV COE序列构建的系统进化树将PEDV毒株分为3个主要的大群，我国主要流行的毒株和本研究中的16株毒株均属于第Ⅰ群，与美国分离株NPL/PEDv/2013和泰国分离株08CB03-2008等属于同一群，与其亲缘关系较近，与韩国分离株KNU-0801、Chinju99亲缘关系较远，虽然第Ⅰ群的遗传背景较为复杂，但是它们与CV777 Vaccine、Attenuated DR13等弱毒株也处于同一大群中，亲缘关系较近。GD/FSss/2014与CV777、DR13等属于第Ⅱ群，与其余16株毒株有一定的遗传距离，GD/FSss/2014 COE的氨基酸点突变也较多，可对其做更进一步的研究。

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Genetic variation analysisof porcine epidem ic diarrhea virus in the southern region of China during 2012 to 2014

SU Dan-ping1，LIBing1，2，ZHANG Xian-hao2，CHEN Rui-ai1，2，CAIJia-yue1，HEDong-sheng1，2
（1.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Guangdong Dahuanong Animal Health Products CO.，LTD，Yunfu 527400，China）

In this study，in order to investigate the variation in the core neutralizing epitope（COE）of Sgene of porcine epi⁃demic diarrhea virus（PEDV），a total of 17 PEDV positive sampleswere collected from different breeding farms from 7 provinces in the southern region of China during 2012 to 2014，and the COEs were amp lified by RT-PCR，cloned and sequenced.Sequence analysis and genetic variation of 17 COEs were compared with other PEDV

trains selected from GenBank.Our results showed that 16 of 17 strainswere closely related to each other and belonged to the first group，and the GD/FSss/2014 strain be⁃longed to the second group.Sequence analysis showed that the COE of 17 strains shared 92.9%～99.8%nucleotide and 88.6%～100%deduced amino acid identities to each other，and exhibited 93.3%～99.5%nucleotide and 90%～98.6%deduced amino ac⁃id identitywith the reference PEDV strain of CV777.Compared with the CV777 vaccine strain，the strains sequenced in this study had 95-97.1%nucleotide and 92.9～97.9%deduced amino acid identity.Meanwhile，therewere some amino acidmutations in the COE.This study could provide the theoretical foundation for selection and further study of comprehensive prevention and control of PEDV.

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）；the core neutralizing epitope（COE）；the southern region of China；genetic evolution

s：HEDong-sheng；CHEN Rui-ai是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起猪的一种急性高度接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死性为主要特征[1]。自1971年比利时和英国首次报道PED之后，在世界各地陆续发生[2]。近几年PED在我国频繁暴发，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[3]。

S852.65+1

A

0529-6005（2015）11-0012-04

2014-10-10

广东大华农动物保健品股份有限公司2012年科研项目

苏丹萍（1965-），女，实验师，本科，主要从事兽医传染病学的研究，E-mail：sdp8528@163.com

贺东生，E-mail：Dhe@scau.edu.cn；陈瑞爱，E-mail：chensa727@126.com