蛤蚧铜绿色假单胞菌与弗氏柠檬酸杆菌混合感染的分离鉴定与药敏试验

赵成坚，黄 勇，谷颖乐，徐永莉，张月云，李 力

（广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023）

蛤蚧铜绿色假单胞菌与弗氏柠檬酸杆菌混合感染的分离鉴定与药敏试验

赵成坚，黄 勇，谷颖乐，徐永莉，张月云，李 力

（广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023）

从濒死蛤蚧的肝脏、肾脏分离出2株革兰阴性杆菌（L1，L2），对分离菌株进行形态学、培养特性、生化特性和分子生物学鉴定，并进行动物毒性试验。结果显示，2株细菌基因组DNA均可扩增得到大小为1 450 bp的特异性片段，该序列与GenBank上已经登录的铜绿色假单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌序列同源性分别达到99%和98%。结合以上几种鉴定方法最终确定L1，L2为铜绿色假单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌。动物毒性试验证明，其对小鼠有较强的致病性。体外药敏试验表明，铜绿色假单胞菌对头孢他啶、环丙沙星、诺氟沙星高度敏感；弗氏柠檬酸杆菌对头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、诺氟沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。

蛤蚧；铜绿色假单胞菌；弗氏柠檬酸杆菌；药敏试验

蛤蚧（Gekko gecko）是主产广西的珍稀动物药材，具有补肺益肾，纳气定喘，助阳益精之功效。主要用于治疗虚劳喘咳、阳痿、神经衰弱和小儿疳积等疾病[1]。近年来，随着以蛤蚧为主要原料的各种药品不断开发，市场对蛤蚧需求量呈上升趋势。由于栖息地破坏和对野生蛤蚧采取灭绝性的捕捉，现有的野生蛤蚧资源已难以满足市场的需求，人工养殖蛤蚧势在必行[2]。在人工养殖过程中，由于饲养密度增大，饲料品种单一，营养不均衡，缺乏必要的阳光照射等，容易发生诸如口腔炎（见中插彩版图1），软骨病（见中插彩版图2），脚趾脓肿[3]等一系列疾病的发生，尤其是细菌性疾病对蛤蚧人工养殖业的发展造成了严重的危害。本研究通过对养殖基地具有典型症状的发病蛤蚧进行实验室检查，首次从其肝脏和肾脏中分离出铜绿色假单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌，利用16S rDNA对分离菌进行分子鉴定。通过动物接种试验测定其致病力，再通过药敏试验分析菌株对各类抗生素的敏感性，以期为蛤蚧的疾病防治提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料及实验动物来源 采集广西药用植物园蛤蚧养殖基地具有典型症状蛤蚧的肝脏、肾脏。小鼠，体重18～20 g，购自广西中医药研究院实验动物中心。

1.2 培养基及试剂 普通营养琼脂培养基、鲜血琼脂平板培养基和麦康凯琼脂平板培养基参照姚火春[4]的方法进行配制。革兰染色试剂盒；常规细菌微量生化鉴定管；EZUP柱式细菌基因组DNA提取试剂盒（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）；16S rDNA引物（27F、1492R），超纯水，Taq DNA聚合

酶，dNTP，10×Taq Buffer缓冲液，分子量标准DL-2 000；头孢噻肟（30μg）、头孢唑林（30μg)、头孢噻吩（30μg）、氨苄西林（10μg）、环丙沙星（5μg）、诺氟沙星（10μg）、丁胺卡那霉素（30μg）、新霉素（30μg）、链霉素（10μg）、复方新诺明（25μg）共10种，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 病理剖检观察 对发病濒死蛤蚧进行剖检，记录眼观病理变化。无菌操作采取有典型病理变化的肝脏，肾脏。

1.4 菌株的分离与纯化、染色镜检 用常规方法进行细菌的分离。取肝脏、肾脏直接在普通营养琼脂平板上划线分离30℃恒温箱中培养24 h。从优势菌落中分别选取单菌落，继续纯化培养24 h。从肝脏分离的菌株暂命名为L1,从肾脏分离的菌株命名为L2。将这两个菌株分别接种于普通营养琼脂培养基、鲜血琼脂培养基和麦康凯营养琼脂培养基上，在恒温条件下培养，24 h后进行涂片，革兰染色，显微镜下观察细菌形态特征。

1.5 生理生化鉴定 细菌的生化鉴定参照姚火春[4]等的方法进行。挑取纯化分离的菌落到微量生化反应管中，观察结果。

1.6 纯化培养后细菌DNA的抽提 细菌DNA的抽提参照试剂盒的说明书进行操作。

1.7 分离菌的16S rDNA扩增 将收集的DNA溶液在PCR仪上扩增。PCR扩增体系为50μL，其中包括dNTP（2.5 mmol/L）4μL，10×Taq Buffer 5 μL，引物27F和1492R各2μL，Taq酶0.3μL，模板DNA 2μL，超纯水34.7μL。反应的程序为95℃预变性5 min；95℃变性45 s；52℃退火1 min，72℃延伸90 s；35个循环；72℃延伸10 min。增加一个对照，其他扩增条件相同，没有增加菌株。将扩增的产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶呈像系统观察并保存。纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序序列在GenBank中Blast比对，选取相关序列，利用分子生物学软件分析同源性。

1.8 动物接种试验 将分离纯化的菌株制成悬液，取体重18～20 g小鼠30只，分为3组，每组10只。试验组分别腹腔注射0.5mL/只，浓度为（9× 108CFU/mL）的细菌悬液；对照组小鼠腹腔注射同剂量的灭菌生理盐水。观察小鼠的发病状况和死亡情况，采内脏实质器官作涂片镜检和接种培养基分离培养，依据上述方法进行菌种鉴定。

1.9 药敏试验 取2株分离菌株进行药敏试验，具体操作步骤参照药敏试纸使用说明书。

2 结果与分析

2.1 病理剖检观察 肝脏质地较硬，有白色的结节分布（见中插彩版图3），肾脏肿大，有出血点（见中插彩版图4）。

2.2 菌株的分离培养及染色镜检 两菌株在显微镜下的形态特征及培养特性如表1所示。

表1 菌株的形态特征及培养特性

2.3 生理生化测定 L1菌株能分解葡萄糖，产酸产气；不分解麦芽糖、乳糖。甲基红试验、吲哚试验、V-P试验阴性。L2菌株氧化酶试验、V-P试验、吲哚试验阴性、不分解麦芽糖，发酵葡萄糖产酸产气。如表2所示。

表2 L1、L2菌株的生理生化性状

2.4 16S rDNA序列分析 凝胶电泳结果显示，L1菌株与L2菌株均可扩增出约1 450 bp片段（图5）。将这两株菌的16S rDNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行核酸同源性检索。L1与GenBank数据库登录的铜绿色假单胞菌（登录号FJ972535.1）序列相似度为99%。L2与GenBank数据库登录的弗氏柠檬酸杆菌（登录号AF025365.1）序列相似度为98%。结果表明，L1为铜绿色假单胞菌，L2为弗氏柠檬酸杆菌。

2.5 动物接种试验结果 接种菌液的小鼠于接种后12 h发病，病鼠表现精神沉郁，蜷卧不动，聚堆寒颤。18 h后陆续出现死亡，对照组无发病或死亡。剖检发现肝脏肿胀、淤血，并有多个灰白色坏死灶；肾脏肿大、变脆，取内脏器官按上述方法进行无菌

分离菌种，并用理化方法和16S rDNA PCR法鉴定，结果与病料中分离到的两株菌一致。

图5 16S rDNAPCR结果M：DL-2 000；L1、L2：菌株16S rDNA产物；C：对照

2.6 药敏试验结果 利用涂布法对L1，L2菌株进行常用药物的敏感性测定，试验判定结果表明，L1菌株对头孢他啶、环丙沙星、诺氟沙星敏感；其他药物均表现为耐药。L2菌株对头孢唑林、复方新诺明、链霉素中介，氨苄西林、新霉素耐药，其他药物均表现敏感。见表3。

表3 菌株的药敏试验结果

3 讨论

铜绿色假单胞菌感染后因脓汁和渗出液等病料呈绿色，故又称为绿脓杆菌，广泛存在于自然界、人和动物的皮肤、呼吸道、肠道等。在正常情况下，对动物和人体基本无毒或弱毒，但出现移位寄居、菌群失调或宿主防御机能降低时，常可引起严重感染[5]。近年来，陆续有报道从病死的猛禽[6]、雏鸡、雏鸭等禽类、水貂[7]、大熊猫[8]、小尾寒羊[9]。甚至是昆虫大麦虫[10]分离到此菌，且具有致病力。张月云[3]等，利用高锰酸钾与复方新诺明等治愈了蛤蚧因感染铜绿色假单胞菌而引起的口腔炎。而本研究的药敏试验表明，此菌株对包括复方新诺明、丁胺卡那霉素等多种抗生素表现出耐药性。经调查，在蛤蚧养殖过程中喂食了人工养殖的黄粉虫，大麦虫等，并未使用过抗生素，说明耐药菌株的存在与耐药基因的遗传和转移有关，由于铜绿色假单胞菌固有的特性，表现出对内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素、喹诺酮类、四环素类和磺胺类药物等表现出存在天然或者获得性多重耐药，使得用药起来十分困难。

弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科枸橼酸杆菌属，广泛分布于自然界中，是哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类动物肠道内正常的菌群，为条件致病菌。国内外关于弗氏柠檬酸杆菌导致水产养殖动物患病死亡的病例已有报道，李华等[11]首次报道弗氏柠檬酸杆菌可引起河蟹感染败血症，病蟹鳃组织大面积肿胀、坏死。舒新华等[12]报道了养殖乌鳢感染弗氏柠檬酸杆菌后引发了腹水病，病鱼主要表现突眼，竖鳞，皮下积水，肛门红肿，肝脾肾肿大等症状。沈锦玉等[13]报道红螯螯虾感染该菌后，虾尾部肉质样肿胀或溃烂，肝胰腺棕黄色。

本试验首次发现了蛤蚧混合感染铜绿色假单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌，并均有较强的致病性，严重侵害蛤蚧的肝脏及肾脏，最终导致死亡。在药物的选择上，使用头孢他啶、环丙沙星、诺氟沙星等将取得最佳的治疗效果。

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[2]李汉华，唐振杰，庾太林，等.广西大壁虎资源及保护[J].广西师范大学学报（自然科学版），1996，14（2）：62-66.

[3]张月云，潘红平，赵成坚，等.治疗蛤蚧脚趾脓肿方法的研究[J].广西医学，2006，6：800-802.

[4]姚火春.兽医微生物学实验实习指导[M].北京：中国农业出版社，2005.

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[6]王月虎，李瑛，李焕荣.猛禽源绿脓杆菌分离鉴定及药敏试验[J].中国兽医杂志，2011，47（1）：83-84.

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R 378.91

B

0529-6005（2015）11-0052-03

2014-05-27

广西科技厅项目（桂科重12118005-2-5）；南宁市科技攻关项目（20123238）

赵成坚（1979-），男（壮族），助理研究员，硕士，从事药用动物养殖及疾病防治研究，E-mail：yournut@126.com

李力，E-mail：liboshi1963@vip.163.com