嗜酸乳杆菌胞外多糖对TGEV感染ST细胞分泌IFN-γIL-6 IL-8的影响

王莹莹，刘文娜，魏 萍，王子敬，张 萍

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

嗜酸乳杆菌胞外多糖对TGEV感染ST细胞分泌IFN-γIL-6 IL-8的影响

王莹莹，刘文娜，魏 萍，王子敬，张 萍

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

为研究抗病毒嗜酸乳杆菌菌株的细胞机制，利用嗜酸乳杆菌胞外多糖（EPS）作用于猪睾丸细胞（ST），以MTT法检测其是否抑制猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染，并观察IFN-γ、IL-6、IL-8的mRNA表达水平。本试验分为4组，分别是正常细胞对照组（Control组）、TGEV感染组（TGEV组）、EPS预处理感染TGEV组（EPS+TGEV）组和胞外多糖组（EPS组），在2、4、6、12、24 h时采集细胞样品，通过荧光定量PCR方法检测不同时间点各组细胞中IFN-γ、IL-6、IL-8 mRNA的表达量。结果发现，EPS具有抑制TGEV感染ST细胞的效应；EPS组、TGEV组和EPS+TGEV组IFN-γ、IL-6、IL-8mRNA表达量较Control组比都相对增加，三种细胞因子随着时间的延长，均呈现出先快速增加后减少回归到正常水平的趋势。EPS+TGEV组在感染2 h时IL-8mRNA表达量达到最大值，4 h时IL-6、IFN-γmRNA表达量达到最大值，且均出现了叠加效应，相比正常细胞对照组差异极显著（P＜0.001）。结果表明，EPS对TGEV感染ST细胞有一定的抑制作用，提高了抗TGEV感染初期IFN-γ、IL-6、IL-8mRNA表达水平。

嗜酸乳杆菌胞外多糖；TGEV；ST细胞；细胞因子

大量研究表明，某些益生菌胞外多糖安全无毒，具有免疫调节、抗肿瘤、降胆固醇、抗氧化等作用[1]。也有报道某些胞外多糖具有抗病毒作用。例如，紫球藻胞外多糖在体外具有抗乙肝病毒作用[2]。嗜酸乳杆菌胞外多糖是嗜酸乳杆菌在生长代谢过程中形成的位于细胞壁外的粘液多糖或荚膜多糖。尽管对嗜酸乳杆菌胞外多糖的免疫调节研究很多，但是关于它的抗病毒研究甚少，尤其是抗猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）。TGEV可引起猪传染性胃肠炎，该病是猪的一种高度接触性和急性传染病，致死率很高，对于该病的防治极其重要。

病毒感染细胞会引起一系列的反应，细胞因

子在抵抗病毒感染的过程中发挥重要作用[3]。IL-6是由免疫细胞和非免疫细胞产生的多效性细胞因子，刺激机体的免疫应答[4]。IL-8是一种重要的趋化分子，能够招募和激活周围的巨噬细胞、淋巴细胞等。IFN-γ具有广谱抗病毒活性，可以抑制病毒感染过程中蛋白质的复制。

本试验通过评价TGEV感染ST细胞中IL-6、IL-8、IFN-γ表达量的变化经EPS对ST细胞处理前后的变化规律，进一步阐明嗜酸乳杆菌胞外多糖在抗病毒过程中调节免疫应答的重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料 TGEV TO163株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘长明研究员惠赠；嗜酸乳杆菌由本实验室分离、鉴定保存；ST细胞由本实验室保存；SYBR®qPCR Mix试剂盒，购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；HiScript®1st Strand cDNA Synthesis kit，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；噻唑兰（MTT），购自北京索莱宝科技有限公司；荧光定量PCR仪ABI7500等。

1.2 方法

1.2.1 EPS的粗提取 在MRS液体培养基中接种试验菌种，37℃厌氧培养18～24 h。菌上清液离心、除蛋白、醇沉获得粗多糖溶液[5]。

1.2.2 EPS的最大无毒剂量 采用MTT法[6]测定。

1.2.3 EPS的抗病毒效果测定 使用已过滤除菌最大无毒剂量的EPS与100TCID50/0.1 mL TGEV（TCID50：10-5.84）等体积加入长成单层细胞的96孔板中，采用MTT法测定[7]。

病毒抑制率=（胞外多糖预处理组平均OD值-病毒对照组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值）×100%。

1.2.4 TGEV感染ST和试验分组 ST细胞以2.0×105个/mL的密度接入6孔板，细胞长满单层后待用。实验分为正常细胞对照组、TGEV感染组、EPS预处理感染TGEV组、EPS对照组。EPS作用细胞2 h后，弃去上清，D-hanks洗3遍，加入TGEV，作用1 h，去掉吸附液，加入DMEM细胞维持液继续培养。分别在病毒感染细胞2、4、6、12、24 h后，弃上清，PBS洗细胞2次，收集细胞，直接提取细胞的RNA或放-80℃备用。

1.2.5 引物的设计与合成 根据GenBank中猪的IL-6、IL-8、IFN-γ基因及参考基因β-actin的序列，设计特异引物并合成（见表1）。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.2.6 标准品质粒的构建 按照Fast200试剂盒提取细胞RNA，以RNA为模板，按照HiScript®1st Strand cDNA Synthesis kit反转录，合成的cDNA于-20℃保存备用。对目的及内参基因进行常规PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，与pMD18-T载体连接、转化大肠杆菌感受态细胞DH5-α，基因克隆，提取质粒，筛选阳性质粒送测序公司测序，提取的质粒10倍倍比稀释10个稀释度，每个稀释度设3个平行，-80℃保存备用。

1.2.7 标准曲线的绘制 按SYBR®qPCRMix试剂盒说明，建立20 uL实时荧光定量PCR反应体系，β-actin、IL-6、IL-8、IFN-γ退火温度分别为60℃、60℃、55℃、59℃，PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，退火30 s，72℃延伸40 s，40个循环。以稀释好的质粒为模板，PCR仪检测后，根据Ct值，取5个点绘制标准曲线。

1.2.8 目的基因实时荧光定量PCR检测 将不同处理组不同时间点的目的及内参基因以cDNA为模板进行荧光定量PCR的检测，反应条件同上。

2 结果

2.1 EPS的最大无毒剂量 EPS剂量测定发现，在剂量低于原剂量10-3时细胞存活率与空白组接近。确定最大无毒剂量为10-3稀释度。

2.2 EPS的抗病毒效果测定 MTT法结果显示，EPS的病毒抑制率为45.65%（见表2）。

2.3 标准品质粒的制备 内参与目的基因PCR扩增，得到与预期大小一致的扩增产物（见图1）。序列测定证实成功构建了质粒标准品。

表2 OD490结果

图1 内参及目的基因PCR扩增结果（M：Marker；-：阴性对照；A：β-actin；B：IL-6；C：IL-8；D：IFN-γ）

2.4 标准曲线的建立 根据Ct值仪器制作标准曲线、扩增曲线（见图2）、熔解曲线。标准曲线线性关系良好，相关系数R2均大于0.98（见图3）。熔解曲线表明，4种分子均出现特异性单峰（见图4）。

2.5 目的基因实时荧光定量PCR检测 TGEV组、EPS+TGEV组、EPS组在作用初期均能刺激IL-6、IL-8、IFN-γmRNA相对表达的增加且EPS+ TGEV组出现了叠加效应。随着时间的延长，基因表达回归到正常水平。TGEV组在4 h时IL-6和IL-8基因表达达到最大值，6 h时IFN-γ达到最大值；EPS组在2 h时IL-6达到最大值，4 h时IL-8达到最大值，6 h时IFN-γ达到最大值；EPS+TGEV组在2 h时IL-8达到最大值，4 h时IL-6、IFN-γ达到最大值（见图5）。

3 讨论与结论

图2 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ实时荧光定量PCR扩增曲线

图3 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ实时荧光定量PCR标准曲线

图4 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ实时荧光定量PCR熔解曲线

图5 不同时间点不同处理组IL-6、IL-8、IFN-γmRNA相对表达量的变化

已经证明嗜酸乳杆菌及其培养上清均具有抗病毒作用[8]。但培养上清里具体是哪1种物质起到了抗病毒作用尚未解决。本试验我们粗提了1株嗜酸乳杆菌的胞外多糖，并测定了EPS的最大无毒剂量，以该剂量作用ST细胞，发现提取的EPS具有一定的抗TGEV的作用。荧光定量PCR结果通过双ΔΔCt法分析表明，TGEV和胞外多糖都可以增加ST细胞IL-6、IL-8、IFN-γmRNA的表达，不同时间点表达量不同。EPS＋TGEV组在作用ST细胞初期可以明显增加IL-6、IL-8、IFN-γ mRNA的表达，出现叠加效应，促进细胞的免疫活性，增强细胞对TGEV的抵抗力。IL-6、IL-8、IFN-γ随着试验时间的延长，表达量均趋向于正常细胞对照组，表明EPS只是暂时性地诱导3种细胞因子的表达，这使EPS既可以增强细胞的免疫功能，又不会引起免疫过度，造成损害。细胞抵抗病毒感染是一个复杂的过程，后续我们将对该胞外多糖抗病毒活性和抗病毒机制做更深入的研究。

结论：EPS具有一定的抗TGEV能力，在作用ST细胞初期增加IL-6、IL-8、IFN-γmRNA的表达，刺激细胞的免疫，增强细胞对TGEV的抵抗力。

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Expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 in ST cells infected w ith TGEV and on the intervention of Lactobacillus acidophilus extracellular polysaccharides

WANG Ying-ying，LIUWen-na，WEIPing，WANG Zi-jing，ZHANG Ping
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To study the antiviralmechanism of Lactobacillus acidophilus，we treated ST cellswith EPS.MTT assay was used to verify EPSanti-TGEV effect.Detection of the expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 were performed.The studywere divided into four groups：control group，TGEV group，EPSwith TGEV group，and EPSgroup.We collect the cells at 2 h，4 h，6 h，12 h，and 24 h after cellswere treated differently，and then analyzed themRNA expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 in ST cells at different time points and different treatmentgroups by Real-time PCR.Itwas found that EPSeinhibited TGEV infection in ST cells.IFN-γ，IL-6，and IL-8mRNA expressions in EPSgroup，TGEV group，and EPS+TGEV group were relatively higher than those in the control group.With the extension of time，themRNA expressions of IFN-γ，IL-6，and IL-8 all showed a trend：first increase，then a decrease，and back to normal levels.In EPS+TGEV group，themRNA expression of IL-8 reached its peak at 2 h，and IFN-γ and IL-6 reached theirmaximum at 4 h.Our data show that EPS can enhance the ability of ST to inhibit TGEV by the increased expressions of IFN-γ，IL-6，and IL-8.

EPS；TGEV；ST cells；cytokines

WEIPing

Q939.11+7

A

0529-6005（2015）11-0045-04

2015-01-27

黑龙江省教育厅重点项目（12521z001）；哈尔滨科技局项目（2014RFXGJ096）

王莹莹（1988-），女，硕士生，研究方向为益生菌抗猪胃肠道病毒，E-mail：825365352@qq.com

魏萍，E-mail：weiiping@163.com