VEGF165b和VEGF165在胃癌组织中的表达及与预后的关系*

关云艳，诸静芬，欧希龙，吴海荣，吴锡平，王倩

（1.江苏省无锡市中医医院消化内科，江苏 无锡 214071；2.东南大学医学院附属中大医院，消化内科，江苏 南京 210009）

·临床论著·

VEGF165b和VEGF165在胃癌组织中的表达及与预后的关系*

关云艳1，诸静芬1，欧希龙2，吴海荣1，吴锡平1，王倩1

（1.江苏省无锡市中医医院消化内科，江苏 无锡 214071；2.东南大学医学院附属中大医院，消化内科，江苏 南京 210009）

目的研究VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁正常组织中的表达及胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA与预后的关系。方法分别应用实时RT-PCR和免疫组织化学法检测胃癌及癌旁正常组织中VEGF165b和VEGF165的基因及蛋白表达，并对患者进行2年的随访，比较VEGF165b mRNA/ VEGF165 mRNA比值及这两种蛋白表达水平在胃癌及癌旁组织中的变化；同时分析VEGF165b与VEGF165蛋白表达的相关性以及胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA与预后的关系。结果在胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常组织中的水平；在癌旁正常组织中VEGF165b基因及蛋白表达强于VEGF165，在胃癌组织中VEGF165b基因及蛋白的表达则低于VEGF165，而且两者表达呈负相关关系；此外，在两年内死亡的患者中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA明显低于生存患者中的比值水平。结论与正常组织相比，胃癌组织中存在VEGF165b向VEGF165基因及蛋白水平上的优势转换，这种变化有望成为治疗胃癌的新靶点。

VEGF165b；VEGF165；实时RT-PCR；免疫组织化学；胃癌

目前已知肿瘤的生长和转移依赖于血管的形成，而这一过程主要是由于促血管生成因子和抑制因子调控失衡，促血管生成因子增多所致。其中作用最强的就是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），但近年来研究结果显示并不是所有的VEGF变构体都有此作用，其新型剪接变构体-VEGFxxxb则具有抑制血管形成的作用。由于VEGF165在VEGF-A中所占比例最高，且生物活性最强，故在临床和实验中应用最广，相应地VEGF165b也就受到颇多关注。为此，该研究应用实时RT-PCR、免疫组织化学方法分别检测胃癌及癌旁正常组织中VEGF165b、VEGF165基因及蛋白的表达情况的变化；并分析这两种蛋白表达的相关性以及VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA与预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1材料与试剂

选取东南大学附属中大医院2009年9月-2010年9月进行手术的胃癌患者48例。所有患者均有完整的临床及病理资料，术前均未行化疗或其他针对肿瘤的治疗，癌旁正常组织是取距离癌组织5 cm以上的外观正常的组织。其中男34例，女14例；年龄25～79岁，平均（59.08±11.63）岁。病变直径≥5 cm者28例，＜5 cm者20例。根据TNM临床分期标准，Ⅰ期4例，Ⅱ期16例，Ⅲ期26例，Ⅳ期2例。有淋巴结转移的35例，无转移的13例；侵犯血管形成癌栓者29例，未侵犯血管者19例；病理类型显示腺癌分别为35例，腺鳞癌2例，鳞癌3例，印戒细胞癌8例。

荧光定量PCR试剂盒（SYBRGreen）购于TaKaRa公司，引物由南京凯基生物公司合成，VEGF165、 VEGF165b一抗均购自英国abcam公司，免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物工程技术公司。

1.2实验方法

1.2.1实时RT-PCR方法检测胃癌及癌旁正常组织中VEGF165b mRNA、VEGF165 mRNA的表达以Trizol提取标本中总RNA，取RNA样品用1×TE Buffer稀释样品100倍，测定样品在260nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。按以下计算RNA的浓度=A260×稀释倍数×0.04μg/μl，A260/280在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。然后逆转录合成cDNA，接着进行荧光定量PCR，以cDNA为模板，表1显示序列为引物，反应体系（20μl）：2×Realltime PCR Master Mix（SYBRGreen）10μl+模板（cDNA稀释10倍）1μl+引物MIX（F/R各为10μmol）2μl+DEPC 7μl。反应条件：95℃5 min，95℃15 s，63℃30 s，72℃30 s，40个循环。

1.2.2免疫组织化学方法检测胃癌组织及癌旁正常组织中VEGF165b、VEGF165蛋白的表达所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4μmol的连续切片，采用免疫组织化学SP法检测胃癌手术标本的肿瘤组织和癌旁正常组织中VEGF165和VEGF165b的表达。应用微波炉恒温抗原修复后滴加相应一抗（1∶100），孵育过夜后滴加二抗（1∶500）及DAB显色，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照组，已知结肠癌阳性片作阳性对照组。以细胞结构中存在粗细一致的棕黄色颗粒为阳性，其中VEGF165b和VEGF165阳性颗粒均分布于细胞胞浆。双盲法随机观察5个不同高倍视野，各计数500个细胞，判断标准如下：根据染色的细胞数量及染色强度分为阴性（-），无阳性细胞染色或阳性细胞数＜10%；弱阳性（+），阳性细胞在10%～25%之间；中度阳性（++），阳性细胞25%～75%；强阳性

（+++）,阳性细胞＞75%。

1.3统计学方法

采用SAS 8.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间两两比较用t检验，计数资料进行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1胃癌及癌旁正常组织中VEGF165b mRNA、VEGF165 mRNA的表达

胃癌组织中VEGF165 mRNA的相对表达量（5.363±2.499）高于癌旁正常组织（1.899±0.759），两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。VEGF165b mRNA在胃癌组织中表达的相对量是（1.549± 0.5819），低于在癌旁正常组织表达的相对量（2.960±1.043），差异有统计学意义（P＜0.01）。而且VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA这一比值在癌旁正常组织中高于胃癌组织（P＜0.01）。见图1。

图1 VEGF165b mRNA and VEGF165 mRNA在胃癌及癌旁正常组织中的差异性表达

2.2VEGF165b和VEGF165蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达

在胃癌组织中VEGF165b和VEGF165表达的阳性率分别为27.08%和64.58%，在癌旁正常组织中VEGF165b和VEGF165表达的阳性率分别为75.00%和39.58%。VEGF165b和VEGF165在胃癌及癌旁组织中表达程度不同，差异有统计学意义。在胃癌组织中VEGF165b表达低于VEGF165（见图2B和图3B），而在癌旁正常组织中VEGF165b表达则强于VEGF165（见图2A和图3A）。

图2 VEGF165b的表达

图3 VEGF165的表达

2.3VEGF165b和VEGF165蛋白表达的相关性

胃癌及癌旁组织标本共96例，两者间表达呈负相关性（P=0.0064，Pearson系数=0.3808）。见表2。

表2 VEGF165和VEGF165b表达的相关关系

2.4胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA的比值与预后的关系

在两年的随访中，有3例失访，45例中有16例死亡。两年死亡率35.6%。胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA在生存组中为（0.415± 0.271），死亡组中为（0.26±0.135），两组比较差异有统计学意义（t=2.53，P=0.016）。

3 讨论

在肿瘤的生长过程中VEGF165起着至关重要的作用，促进肿瘤生长的机制除促进血管形成以外，对某些体外培养的肿瘤细胞也有直接的促增殖作用[1-2]，并能增加肿瘤对化学药物的抗药性[3]。2002年BATES等[4]分离出血管内皮生长因子VEGF-A的新型剪接变构体－VEGF165b，选择性剪接发生于外显子8的远端，在结构上与VEGF165相比，仅表现为终末6个氨基酸的不同，VEGF165b与VEGFR-2的

亲和力等同于VEGF165，但仅能微弱而短暂地激活VEGFR2及其下游信号分子，从而竞争性地抑制VEGF165生物学作用的发挥，起到抑制VEGF165所诱导的内皮细胞增殖、迁移及血管舒张、血管生成的作用。随后研究人员也证实VEGF xxxb这一抑制性剪接变构体家族的存在。VEGF165b多存在于正常细胞、组织及血液循环中，尤其在具有高水压传导性的组织如脉络丛以及肾小囊足细胞表达较高[5]，在肾细胞癌、前列腺癌中表达均下调。后来PRITCHARD-JONES等[6]研究显示，在正常表皮和一部分恶性黑色素瘤的标本中有VEGF165b的表达，但在肿瘤标本中表达微弱；而且与未发生转移的肿瘤相比，在随后发生转移的肿瘤组织中VEGF165b表达明显减少，而周围正常组织的VEGF165b表达没有变化。RENNEL[7]用裸鼠构建结肠癌模型，随后以重组VEGF165b蛋白腹腔内注射，结果显示VEGF165b重组蛋白抑制肿瘤的生长。

目前，为止发现在肾细胞癌[4]、前列腺癌[4]、恶性黑色素瘤[6]、食管癌[8]、结直肠癌[9]中表达均下调，但在膀胱癌中表达情况尚有争议，DAS等[10]研究显示在膀胱移行细胞癌中VEGF165b表达上调，也有VEGF165b在膀胱移行细胞癌中表达下调的报道[11]。目前，这方面研究仅限于上述肿瘤，尚无VEGF165b在胃癌中表达情况的研究，而笔者通过应用实时RT-PCR及免疫组织化学方法证实VEGF165b基因及蛋白在癌旁正常组织中表达高，在胃癌组织中表达降低，VEGF165的表达情况正好相反；此外，胃癌组织中VEGF165b mRNA/VEGF165 mRNA低于癌旁正常组织中的比值，这一比值下降程度越明显，预后就越差，而且这两种蛋白表达程度呈负相关性。由此认为，在胃癌组织中也存在VEGF165b向VEGF165的剪接优势转换，因此控制这种剪接转换或补充外源性VEGF165b有望成为治疗胃癌的关键。NOWAK等[12]研究一些细胞内剪接因子及细胞外生长因子对该选择性剪接的影响，结果显示SRp55、TGF-β1可上调VEGF165b基因及蛋白的表达，抑制p38 MAPK途径则降低后者所诱导的远端选择性剪接的发生。CIURA等[13]报道丁酸盐可以上调人肺微血管内皮细胞VEGFxxxb基因的表达水平，同时也伴随着相应蛋白的增加。以上结果还仅限于体外实验，如果能在体内控制VEGF mRNA的剪接模式，将会有重要的临床应用价值，这也是以后的研究方向。

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[12]NOWAK DG,WOOLARD J,AMIN EM,et al.Expression of pro-and anti-angiogenic isoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growth factors[J].J Cell Sci,2008,121 (Pt 20):3487-3495.

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（张蕾 编辑）

Expressions of VEGF165b and VEGF165 in gastric carcinoma and their correlations with prognosis*

Yun-yan GUAN1,Jing-fen ZHU1,Xi-long OU2,Hai-rong WU1,Xi-ping WU1,Qian WANG1
(1.Department of Gastroenterology,Wuxi Traditional Chinese Medicine Hospital,Wuxi,Jiangsu 214071,P.R.China;2.Department of Gastroenterology,the Affiliated Zhongda Hospital, Clinical Medical College,Southeast University,Nanjing,Jiangsu 210009,P.R.China)

【Objective】To investigate the expressions of VEGF165b and VEGF165 mRNA and proteins in gastric carcinoma and the adjacent normal tissue,and to investigate the correlation between the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in gastric carcinoma and the patients'prognosis.【Methods】The expressions of VEGF165b mRNA and VEGF165 mRNA in gastric carcinoma and the adjacent normal tissue were measured by RT-PCR and the expressions of VEGF165b and VEGF165 proteins were examined by immunohistochemistry.The relationships between the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA and the patients'prognosis were determined.【Results】The ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in the gastric carcinoma was lower than that in the adjacent normal tissue.The expressions of VEGF165b mRNA and protein were higher than those of VEGF165 in the normal tissue.However,the expressions of VEGF165b mRNA and protein were lower than those of VEGF165 in the gastric carcinoma tissue.There was a negative correlation between the protein expressions of VEGF165b and VEGF165.Furthermore,the ratio of VEGF165b mRNA to VEGF165 mRNA in the patients who were dead in two years was lower than that of the survivals.

VEGF165b;VEGF165;RT-PCR;immunohistochemistry;gastric carcinoma

R735.2

A

1005-8982（2015）27-0041-04

2015-05-26

无锡市科技局资助课题（No：CSE00907）

【Conclusions】Compared with the normal tissue,there is a predominant conversion from VEGF165b to VEGF165 in both mRNA and protein levels in gastric carcinoma,which can be a new target for treating gastric carcinoma.