热应激预处理对创伤性休克大鼠早期脑组织中一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶的表达与脑损伤的影响

马轶杰，崔薇，李建华，马献昆，于立，蔡云鹏，王帮奎

(新疆生产建设兵团医院1.神经外科，2.干部保健科，新疆 乌鲁木齐 830000）

·论著·

热应激预处理对创伤性休克大鼠早期脑组织中一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶的表达与脑损伤的影响

马轶杰1，崔薇2，李建华1，马献昆1，于立1，蔡云鹏1，王帮奎1

(新疆生产建设兵团医院1.神经外科，2.干部保健科，新疆 乌鲁木齐 830000）

目的研究热应激预处理对创伤性休克早期大鼠脑组织一氧化氮（NO）浓度、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达量与脑组织病理改变的影响。方法96只SPF级雄性SD大鼠随机均分为未处理组和处理组，每组又分别设未休克组、休克后0 h、1 h、2 h、3 h及4 h组6个亚组，热应激预处理后建立创伤性休克模型，留取脑组织，观察脑组织病理学和检测脑组织NO浓度、iNOS mRNA表达量的变化。结果病理观察可见处理组各时间点脑病理损伤较未处理组病理损伤轻；NO浓度处理组均低于同时间点未处理组，休克后0 h时均有升高（P＜0.05），休克后1 h时脑组织NO浓度均有明显降低（P＜0.05）；iNOS mRNA表达量处理组均低于同时间点未处理组，未处理组在休克后3 h出现一个峰值（3.50±0.150）u/mg·prot。结论热应激预处理能明显降低创伤性休克大鼠早期脑组织中NO、iNOS的表达,减轻创伤性休克早期大鼠脑损伤。

热应激；创伤性休克；脑；损伤

创伤性休克是由于机体遭受暴力作用后，造成重要脏器损伤、严重出血等情况，使患者有效循环血量锐减，微循环灌注不足，以及创伤后的剧烈疼痛、恐惧等多种因素综合形成的机体代偿失调的综合征。研究表明，50%的战伤死亡是急性失血所致，约1/3的创伤患者死于入院前失血性休克，发生在创伤后2 h内的致死率为20%[1]，其中脑是最早出现损伤的器官之一。热应激是指机体在高环境温度中做出的一系列非特异性全身应答反应。研究表明，热应激预处理可激活机体内在的保护性机制减轻创伤性脑损伤对机体的损害[2]，但热应激对创伤性休克后继发性脑损伤的影响尚未见文献报道，为观察热应激对创伤性休克大鼠继发性脑损伤的影响，本实验通过高温预处理后建立创伤性休克模型，探讨热应激预处理对创伤性休克大鼠早期脑组织中一氧化氮（NO）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达及对脑损伤的影响，并对其变化规律进行研究。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组

实验使用SPF级SD雄性大鼠（n=96，年龄8～10周，体重280～320 g）从新疆疾控中心购得。自购入后适应实验室环境1周，饲养环境保持：温度（22± 1）℃，相对湿度（50±5）%，大鼠由无菌饲料喂养，自由摄食和饮水。实验大鼠随机分成两组：处理组和未处理组，每组又分别设未休克组、休克后0、1、2、3 h及4 h组6个亚组，每组8只。

1.2主要实验器材及环境

BL-420F生物机能监测系统（成都泰盟公司），BI-2000电子计算机图像分析仪（成都泰盟公司），酶标仪、荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司），CS1O1-2D型电热鼓风干燥箱(重庆四达实验仪器厂），NO测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），iNOS引物（上海生物工程有限公司合成），正向引物：5'-GAAAGC GGTGTTCTTTGCTTCT-3'，反向引物：5'-CTTATCTG TTCCATGCAGACAACCT-3'；β-actin正向引物：5'-AACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，反向引物：5'-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3'。

1.3实验方法

1.3.1模型制作实验前大鼠常规禁食、禁水6 h。处理组大鼠置于铁笼中放入电热鼓风干燥箱内使其肛温缓慢达到42℃并维持15 min，参照孙英刚等[3]建立的创伤失血性休克模型，3%戊巴比妥腹腔麻醉，使用静脉留置针行右颈动、静脉和右股动脉插管，右颈动脉插管接生物机能监测系统测量血压等血流动力学指标，颈静脉插管建立简易补液通道，右股动脉插管以备放血。大鼠稳定10 min后，利用2 500 g铁轮于30 cm高度击中大鼠左下肢股骨中上段造成粉碎性骨折，致伤后简易包扎伤口；经右股动脉放血使平均动脉压（mean artery pressure，MAP）维持在（35± 5）mmHg，若经打击后血压不能维持则通过补液通道输注生理盐水以维持MAP。模型完成时间控制在15～20 min，并以大鼠MAP达到（35±5）mmHg为休克0 h时间点。未处理组除不进行热应激处理外，其方法同处理组，两组中未休克组除不致伤外其余步骤同各实验组。

1.3.2脑组织取样按休克后5个时间点处理各组大鼠，达到休克维持时间点后马上切取脑组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，其余脑组织置于-80℃冻存，两组中未休克组在插管完成后即进行取样。

1.4观测指标及方法

1.4.1脑组织NO测量称取0.1g脑组织，在4℃生理盐水中漂洗、拭干，于玻璃匀浆管中手工匀浆，用1 ml生理盐水冲洗转移至1.5 ml EP管内制备成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，留取上清液，测定光密度（optical density，OD）值，计算各样本浓度。

1.4.2脑组织iNOS mRNA表达量提取脑组织总RNA并测量浓度，计算20μl反转录体系所需体积，然后进行反转录得到cDNA，最后以反转录出来的cDNA为模板配成20μl体系，设定扩增参数：95℃预变性3 min；95℃预变性10 s，60℃复性30 s，75℃延伸10 s，共41个循环；最后于75℃延伸10 min，得出iNOS和内参β-actin的Ct值。

1.4.3病理学变化包埋好的脑组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察组织病理变化。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1脑组织NO浓度

未处理组和处理组休克后各时间点脑组织NO

浓度均高于未休克组（P＜0.05）；处理组在休克后脑组织NO浓度均低于未处理组；未处理组和处理组在休克后0 h时脑组织NO浓度有显著升高（P＜0.05），在休克后1 h时脑组织NO浓度均有明显降低（P＜0.05），随时间推移脑组织中NO浓度都逐渐升高，但未处理组升高更明显（见图1）。

图1 脑组织NO浓度比较

2.2脑组织iNOS mRNA表达量

未处理组和处理组在休克后各时间点均高于未休克组（P＜0.05），处理组休克后均低于未处理组，未处理组在休克后3 h出现一个峰值（3.50±0.150）u/mg·prot，而处理组则未出现；未处理组休克后各时间点较前一时间点比较差异有统计学意义（P＜0.05），而处理组差异则不明显（见图2）。

图2 脑组织iNOS mRNA表达量比较

2.3病理学变化

显微镜下发现处理组未休克组，休克后0h组和1h组脑实质无水肿，神经细胞无变化；休克后2 h组脑组织实质轻度水肿，休克后3 h组和4 h组脑组织实质轻度水肿，胶质细胞轻度增生。未处理组在休克后0 h即出现脑组织实质轻度水肿，休克后1 h脑组织肿胀，部分神经细胞核消失，随时间推移脑组织变化明显；处理组各时间点病理变化较未处理组轻（见图3）。

图3 脑组织切片（HE×200）

3 讨论

热应激是机体暴露在热环境中产生的一系列非特异性全身反应，多种细胞因子在热应激发生发展的病理过程起重要作用。创伤性休克会导致有效血容量明显减少、血流灌流不足、微循环障碍，若无法及时得到有效救治，2 h内的致死率为20%[1]，其中脑是最早出现损伤的器官之一。以往研究证实热应激可以提高机体对于有害刺激的耐受力，但对热应激早期影响的报道较少，本实验在经典热应激大鼠模型基础上造成创伤性休克，观察早期脑损伤的特点。

本实验发现，处理组脑病理损伤较未处理组轻，未处理组可见脑组织肿胀，部分神经细胞核消失，随时间推移脑组织变化明显。创伤性休克大鼠致伤前给予热应激处理减轻脑损伤的程度，这可能是由于热应激预处理诱导热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）表达增加，HSP是一组非特异性细胞保护蛋白，有多种功能，因应激诱导机体表达热休克蛋白增加机体细胞耐受不利因素的作用，减轻不利因素对机体细胞的损伤[4]，可见热应激预处理的保护作用是体现在多方面的，包括减轻脑组织的出血、水肿和炎症细胞浸润。

NO是机体内重要的信使分子和效应分子且具有多种生理功能，NO产生过量可激发氧化应激加

重组织损伤[5]，目前不少研究发现，各种伤害刺激包括生物、物理及化学等因素可诱发动物脑内各区NO显著升高[6-7]。本研究发现，未处理组与处理组NO浓度比较存在显著差异，两组在休克后各时间点均高于未休克组，未处理组休克后均高于处理组；另外未处理组与处理组iNOS mRNA表达量同时间点比较存在差异，且各时间点均高于未休克组，未处理组均低于同时间点处理组，未处理组在休克后3 h出现一个峰值（3.50±0.15）u/mg·prot，而处理组则未出现，未处理组休克后各时间点较前一时间点比较差异有统计学意义（P＜0.05），而处理组差异则不明显。有研究[8]表明，由iNOS激活产生的NO呈现神经毒性作用，损伤脑血管内皮的完整性，使其通透性增加导致脑水肿。由此可见，未处理组随着休克时间的延长，可能是由于创伤性休克进而激发iNOS表达量增加，NO大量产生，进而生成强毒性的氧自由基造成脑的广泛性损伤，而处理组由于热应激作用使大鼠机体增加对休克的耐受能力，或者是热应激抑制iNOS/NO途径，从而与未处理组比较iNOS的表达明显降低。

另外，未处理组与处理组NO浓度在休克后0 h时均有显著升高，应考虑是在建立创伤性休克模型过程中，由于有效循环血量锐减、剧烈疼痛等多种因素导致大鼠为维持正常生理状态产生过多NO所引起；未处理组与处理组NO浓度在休克后1 h时均有显著降低，以往有学者研究[9]表明，在应激和一些疾病条件下，NO的合成明显升高，似乎与以往的研究结果矛盾，但以往研究多为NO在应激、创伤或疾病几天后的变化，最早也是在4～6 h。休克后NO浓度下降的原因可能是由于热应激或者创伤休克时，由于机体大量出汗或血容量的减少造成NO丢失[10]；热应激使机体产生大量的热休克蛋白[11]，HSP可以在转录水平上抑制iNOS的表达，而细胞因子对NO合成的促进作用恰是通过高水平的iNOS mRNA来实现的，因此在应激早期，HSP对NO生成起到一种抑制作用，而且处理组较未处理组降低得更显著，说明热应激预处理诱导机体合成更多的HSP。

综上所述，热应激预处理能明显降低创伤性休克大鼠早期脑组织中NO、iNOS的表达，对创伤性休克大鼠脑损伤有明显的保护作用，为创伤性休克提供一种早期预防和救治措施。

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（张蕾 编辑）

Changes of NO and iNOS expression in brain tissue and injury of brain in traumatic shock rats preconditioned with heat stress

Yi-jie MA1,Wei CUI2,Jian-hua LI1,Xian-kun MA1,Li YU1, Yun-peng CAI1,Bang-kui WANG1
(1.Department of Neurological Surgery,2.Department of Geriatrics,Bingtuan Hospital of Production and Construction of Xinjiang,Urumqi,Xinjiang 830000,P.R.China)

【Objective】To research nitric oxide(NO)concentration,induced nitric oxide synthase(iNOS) mRNA expression and the pathological changes of brain tissue in traumatic shock rats preconditioned with heat stress.【Methods】A total of 96 male SD rats were randomly divided into untreated group and treatment group with equal number,and each group was equally divided into 6 subgroups:no shock group and shock 0 h group,1 h group,2 h group,3 h group and 4 h group.The model of traumatic shock was established after heat stress pretreatment and the brain tissue was taken for observation of pathological changes and detection of NO and iNOS mRNA expression in brain tissue.【Results】The lesions of brain tissue structure were lighter in the treatment group than those of the untreated group at the corresponding time point.The NO concentration of the treatment group was lower than that of the untreated group at the corresponding time point,both groups had a rise at shock 0 h(P＜0.05)and a reduce at shock 1 h(P＜0.05).INOS mRNA expression of the treatment group was lower than that of the untreated group at the corresponding time point, there was a peak value[(3.50±0.150）U/mg·prot]in the untreated group in 3 h.【Conclusion】Heat stress pretreatment can significantly reduce NO concentration and iNOS mRNA expression in brain tissue and alleviate the brain injury of rats in early stage of traumatic shock.

heat stress;traumatic shock;brain;injury

R641；R-332

A

1005-8982（2015）27-0014-04

2015-03-17

李建华，E-mail：lijh_2008@126.com