高迁移率族蛋白AT-hook2在非小细胞肺癌患者血清中的表达及与预后的关系

杜江，张林

（中国医科大学附属第一医院胸外科，辽宁 沈阳 110001）

·临床论著·

高迁移率族蛋白AT-hook2在非小细胞肺癌患者血清中的表达及与预后的关系

杜江，张林

（中国医科大学附属第一医院胸外科，辽宁 沈阳 110001）

目的探讨非小细胞肺癌患者血清中不同时间高迁移率族蛋白AT-hook2（HMGA2）的表达情况，分析其与预后间的关系。方法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测术前、术后一周及术后一个月52例非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清中HMGA2的表达情况。结果术前及术后一个月HMGA2在NSCLC患者血清中的表达均显著高于对照组（t=2.541，t=2.384，P＜0.05）。术后一周HMGA2的表达水平较术前有显著降低（t= 2.334，P＜0.05）而与对照组差异不大（t=1.138，P＞0.05）。术前及术后一个月HMGA2在血清中的表达水平与淋巴结转移和TNM分期有关。术前和术后一个月HMGA2在血清中阳性表达者无病生存率（DFS）降低，而术后一个月HMGA2血清表达水平是独立的预后影响因素（HR=2.31，95%CI：1.21～4.98，P＜0.01)。结论ELISA法检测HMGA2在患者血清中的水平可以用来作为判断预后的指标，指导治疗。

高迁移率蛋白AT-hook2；转移；酶联免疫吸附试验；无病生存率

转移和复发一直是肺癌诊断治疗上的难点，目前还缺少敏感度较高的临床检测指标。高迁移率族蛋白AT-hook2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）是一种癌基因，在肺癌细胞及组织中高表达，其表达与肿瘤的侵袭转移密切相关[1]，其表达含量有可能成为预测肺癌复发和转移情况的指标。本实验应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked im munosorbnent assay，ELISA）检测方法，测定非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者在不同时期血清中HMGA2的表达水平，研究其与患者预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象

实验组选取2010年6～9月在中国医科大学附属第一医院胸外科接受手术治疗并且由术前或术后病理证实为非小细胞肺癌的患者52例。其中男33例，女19例，年龄39～77岁，中位年龄57岁。所有患者术前均未行抗肿瘤治疗。具体临床病理资料见表1。对照组为16例体检健康者，男8例，女8例，年龄33～65岁，中位年龄44岁。52例患者均获得随访，随访时间6～38个月，中位随访时间22个月。

表1 患者基本临床病理参数（n=52）

告知患者取得的所有标本的目的与用途，可能的风险和后果，并获得患者的签字同意，取得医院医学伦理委员会的批准。

1.2主要试剂和仪器

HMGA2夹心法ELISA试剂盒（美国USCN公司），96孔酶标板（美国Corning公司），低温冷冻冰箱（德国Simens公司），高速离心机（日本Hitachi公司），酶标仪（美国Bio-Rad公司），自动洗板机（日本EKA公司）。

1.3血浆制备

分别于术前、术后1周及术后1个月（化疗前），晨空腹常规静脉采血2 ml，肝素抗凝，4℃，2 000 r/min离心10 min，取上清，置于-80℃冰箱冷冻备用。对照组体检时同法提取。术前、术后1周及术后1月复查时均获得全部52例标本。

1.4酶联免疫吸附试验

严格按照HMGA2 ELISA Kit试剂盒所示步骤进行实验。发光显色后，酶标仪在450 nm测定光密度（optical density，OD）值，取570 nm OD值为校正波长。以标准品浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，由此计算各待测样本的浓度。为便于生存分析，设定1.1 ng/ml为HMGA2表达的定性cut-off值，＞1.1ng/ml为阳性，＜1.1 ng/ml为阴性。

1.5随访方法

52位NSCLC患者，随访时间6～38个月，中位随访时间22个月，随访以复发时间为观察终止时间，主要根据CT、PET-CT等影像学检查结果判定是否复发。随访期间32例出现肿瘤复发，总体复发率61.5%。

1.6统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数比较及

配对样本均数比较用t检验，多样本均数比较用One-Way ANOVA检验。单因素生存率比较用Log-rank检验，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。多因素分析用Cox比例回归风险模型，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HMGA2在非小细胞肺癌患者血清中的变化

术前及术后1个月HMGA2在NSCLC患者血清中的表达均显著高于对照组（t=2.541，t=2.384，P＜0.05）。术后1周HMGA2的表达水平较术前有显著降低（t=2.334，P＜0.05）而与对照组差异不大（t= 1.138，P＞0.05），术后1个月较术后1周HMGA2表达水平有一定提高，但差异无统计学意义（t=1.375，P＞0.05）。见表2。

表2 NSCLC患者不同时期以及对照组HMGA2血清中表达情况（ng/ml±s）

表2 NSCLC患者不同时期以及对照组HMGA2血清中表达情况（ng/ml±s）

组别例数HMGA2浓度水平对照组160.73±0.37术前521.45±0.51术后1周520.98±0.25术后1个月521.17±0.44

表3 NSCLC患者外周血中HMGA2不同时期浓度与临床病理特征的关系

2.2NSCLC患者血清中HMGA2浓度与临床病理因素间的关系

术前HMGA2血清中浓度与年龄、性别、吸烟史、病理分型、分化程度和T分期无关，而与有淋巴结转移和较晚的TNM分期相关（t=4.783，t=3.112，P＜0.05）。术后1周复查HMGA2浓度则与所有纳入的临床病理因素无关（P＞0.05），特别是对有淋巴结

转移和TNM分期较晚的患者浓度值较术前有显著降低（t=0.759，t=0.574，P＞0.05）。而术后1个月复查淋巴结转移者和晚期NSCLC患者HMGA2在外周血中的表达重新出现相关性（t=3.795，t=3.227，P＜0.05）。见表3。

2.3NSCLC患者HMGA2在血清中的表达与无病生存率之间的关系

52例NSCLC患者，随访时间6～38个月，中位随访时间22个月，随访期间有32例复发，总体复发率61.5%。Kaplan-Meier法绘制无病生存率（disease-free survival，DFS）生存曲线，显示术前及术后1个月HMGA2血清表达阴性者较表达阳性者38个月DFS明显要高（χ2=6.45，χ2=8.24，P＜0.05）；而术后1周HMGA2血清表达阳性和阴性DFS无区别（χ2=0.059，P＞0.05），见附图。Log-rank单因素差异性检验结果显示术前HMGA2血清中浓度，术后1个月HMGA2血清中浓度，病理分期，淋巴结转移有DFS差异。进一步采用Cox模型多因素生存分析，结果显示术后1个月HMGA2血清中浓度（HR=2. 31，95%CI:1.21～4.98，P＜0.01）、病理分期、淋巴结转移为独立的DFS影响因素。而其他变量包括年龄、性别、吸烟史、病理类型、病理分级、T分期不是独立的DFS影响因素。

附图 HMGA2阳性表达与阴性表达患者的无病生存率Kaplan-Meier曲线

3 讨论

高迁移率族蛋白AT-hook2是高迁移率蛋白（HMG）家族中的一员，首先在发育期的间质组织中被发现，而在成熟的细胞中很少表达[2]。它在多种细胞过程中承担重要生物学作用，如基因调控，细胞周期，细胞分化以及病毒整合特别是上皮间质转化过程等[2-4]。目前，已经有大量的研究表明HMGA2是一种癌基因，在多种癌细胞及组织中被检出，并且发现其表达与肿瘤的侵袭转移密切相关[5-10]。在肿瘤发生过程中，它被miRNA-let7及miR154等miRNA负向调控[11-12]，同时也作为ceRNA（竞争性内源性RNA）负作用于miRNA[13]。该发现表明HMGA2似乎是肿瘤发生、发展的重要基因节点，其表达含量有可能成为预测肺癌发展水平的指标。

癌基因蛋白在患者外周血中的表达往往是肿瘤细胞代谢，分泌或坏死的产物。已经有人通过在乳腺癌外周血中检测HMGA2的mRNA表达水平来评价其与预后的相关性。并且发现其表达与乳腺癌的分期，转移和预后明显相关[14]。在本实验中，笔者使用HMGA2-ELISA试剂盒检测不同时期外周血中HMGA2的表达水平[15]，结果显示52例NSCLC患者术前及术后1个月外周血中HMGA2的平均表达水平高于16例健康人对照组的平均表达水平（P＜0.05）。但术后1周的NSCLC患者HMGA2的表达水平较术前显著降低（P＜0.05），而与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。结果说明，在NSCLC患者血清中的HMGA2是高表达的，而手术切除肿瘤使得外周血中HMGA2表达水平有显著的降低。术后1个月HMGA2的平均表达水平与术后1周的表达水平差异无统计学意义，而与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。表明术后1个月HMGA2血清表达水平有所恢复。

对不同时期HMGA2血清中表达水平与临床病理因素之间的关系进行分析，发现术前HMGA2血清中表达水平与年龄、性别、吸烟史、病理分型、病理分级、T分期无关，而与淋巴结转移和TNM分期相关

（P＜0.05）。术后1周血清中HMGA2表达水平与所有临床病理因素无关。术后1个月血清中HMGA2表达水平与淋巴结转移和TNM分期相关。表明HMGA2在NSCLC患者血清中的表达与肿瘤转移和较晚的TNM分期相关，提示HMGA2参与NSCLC的复发和转移。手术可能降低HMGA2的血清表达水平，在部分患者中控制肿瘤的复发和转移。

全部52例患者均获得随访，随访截止于2013年11月。随访期间共32例复发，总体复发率61.5%。为验证血清HMGA2表达与肿瘤复发情况之间的关系，根据对照组表达上限设定HMGA2浓度的cutoff值，并绘制血清HMGA2表达情况与无病生存率的Kaplan-Meier曲线。结果显示，术前和术后1个月的血清HMGA2阳性表达与较低的DFS相关，而术后1周的表达水平则与DFS无关。对各临床因素做Log-rank检验，术前血清HMGA2水平，术后1个月血清HMGA2水平，淋巴结转移和TNM分期对DFS的影响存在差异（P＜0.05）。再将这些因素纳入到Cox模型多因素生存分析，结果表明术后1个月血清HMGA2表达水平是独立的预后风险因素，表达阳性意味着术后复发和转移的可能性增大。该结果与相关实验在乳腺癌血清中mRNA的表达结果一致[15]。证明HMGA2应当与NSCLC的转移和复发相关，并影响到患者的预后无病生存率。

虽然应用RT-PCR法检验外周血中的mRNA含量进行HMGA2的检测可能更精确，敏感性更强，但是高昂的价格阻碍它在临床上的实际应用[15-16]。本实验应用相对廉价的ELISA特异性试剂盒进行HMGA2血清浓度的检测，方法成熟，操作简单，并且实验结果证明此法检测出的HMGA2表达水平能够对患者术后是否复发和转移进行预测和判断。进行多时段的HMGA2血清学检测可以作为观察NSCLC术后病情变化的重要指标。

[1]MEYER B,LOESCHKE S,SCHULTZE A,et al.HMGA2 overexpression in non-small cell lung cancer[J].Mol Carcinog,2007, 46(7):503-511.

[2]BUSTIN M,REEVES R.High-mobility-group chromosomal proteins:architectural components that facilitate chromatin function[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,1996,54:35-100.

[3]ADAIR JE,KWON Y,DEMENT GA,et al.Inhibition of nucleotide excision repair by high mobility group protein HMGA1[J]. J Biol Chem,2005,23(1):112-115.

[4]ADAIT JE,KWON Y,DEMENT GA,et al.Inhibition of nucleotide excision repair by high mobilitygroup protein HMGA1[J]. J Biol Chem,2005,280(37):32184-32192.

[5]DING X,WANG Y,MA X,et al.Expression of HMGA2 in bladder cancer and its association with epithelial-to-mesenchymal transition[J].Cell Prolif,2014,47(2):146-151.

[6]KLEMKE M,MULLER MH,WOSNIOK W,et al.Correlated expressionofHMGA2andPLAG1inthyroidtumors,uterine leiomyomas and experimental models[J].J PLoS One,2014,9(2): e88126.

[7]ZHU C,LI J,CHENG G,et al.miR-154 inhibits EMT by targeting HMGA2 in prostate cancer cells[J].Mol Cell Biochem, 2013,379(1/2):69-75.

[8]MULLER MH,DRIESCHNER N,FOCKEN T,et al.HMGA2 expression in the PC-3 prostate cancer cell line is autonomous of growth factor stimulation[J].J Anticancer Res,2013,33(8): 3069-3078.

[9]WU J,WEI JJ.HMGA2 and high-grade serous ovarian carcinoma[J].J Mol Med,2013,91(10):1155-1165.

[10]MORISHITA A,ZAIDI MR,MITORO A,et al.HMGA2 is a driver of tumor metastasis[J].Cancer Res,2013,73(14):4289-4299.

[11]ZHU C,LI J,CHENG G,et al.miR-154 inhibits EMT by targeting HMGA2 in prostate cancer cells[J].Mol Cell Biochem, 2013,379(1/2):69-75.

[12]LEE YS,DUTTA A.The tumor suppressor microRNA let-7 represses the HMGA2 oncogene[J].Genes Dev,2007,21(9):1025-1030.

[13]KUMAR MS,ARMENTEROS ME,EAST P,et al.HMGA2 functions as a competing endogenous RNA to promote lung cancer progression[J].Nature,2014,505(7482):212-217.

[14]韩猛,宋燕.RT-PCR检测乳腺癌患者外周血HMGA2 mRNA表达的意义[J].中国现代医学杂志,2006,16(10):1480-1482.

[15]张志强,何萍,隋承光,等.双抗体夹心ELISA定量检测血清Cap43蛋白方法的建立与评价[J].中国现代医学杂志,2007,17(13): 1561-1564.

[16]何萍,张志强,戴晓淳,等.两种方法检测肺癌患者CAP43蛋白的结果比较[J].中国现代医学杂志,2007,17(20):2477-2481.

（张蕾 编辑）

Expression of HMGA2 in peripheral blood and its correlation with prognosis of non-small cell lung cancer

Jiang DU,Lin ZHANG
(Department of Thoracic Surgery,the First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of HMGA2 in non-small cell lung cancer(NSCLC) at different timing and its correlation with prognosis.【Methods】ELISA was performed to detect the expression of HMGA2 in the peripheral blood of 52 NSCLC before operation,one week after operation and onemonth after operation.The Kaplan-Meier curve and the Cox proportional hazards model were used to evaluate the prognostic role of each studied parameter.【Results】The expression of HMGA2 in NSCLC peripheral blood before operation and one month after operation was higher than that in the healthy controls(t=2.541 and 2.384 respectively,P＜0.05).The expression of HMGA2 one week after operation was significantly lower than that before operation(t=2.334,P＜0.05)and of no difference from that of the controls(t=1.138,P＞0.05).The expression level of HMGA2 was significantly correlated with lymph node metastasis and TNM staging before operation(t=4.783 and 3.112,P＜0.05)and one month after operation(t=3.795 and 3.227,P＜0.05).There was no significant correlation with age,sex,T stage,histological type or differentiation grade(P＞0.05).Univariate analysis showed that the disease-free survival rate of the patients with negative HMGA2 expression was significantly higher than that of the patients with positive HMGA2 expression before operation and one month after operation(χ2=6.45 and 8.24 respectively,P＜0.05).Multivariate Cox regression analysis showed that high expression of HMGA2 one month after operation was a significant prognostic factor of low disease-free survival(HR=2.31,95%CI:1.21～4.98,P＜0.01).【Conclusion】The expression of HMGA2 in

HMGA2;metastasis;ELISA;disease-free survival

R734.2

A

1005-8982（2015）27-0027-05

2015-04-02

张林，E-mail：zhanglin_cmu@126.com，Tel：024-83283488

peripheral blood detected by ELISA could be considered as an important index for predicting prognosis of NSCLC.