厚朴叶与厚朴皮、厚朴花的毒性比较研究

徐文慧，黄玉珊，王 霞，孙朝越，胡存华，周细根，赖 斌，赖 丹

（井冈山大学医学院，江西，吉安 343009）

来源于木兰科木兰属植物厚朴和凹叶厚朴的干燥干皮、枝皮和根皮的中药厚朴，具有燥湿消痰、下气除满的功效。可用于湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳[1]。厚朴作为常用中药，不少常用处方和中成药制剂中都有厚朴，国内外需求量很大[2]。厚朴为多年生高大乔木，其树皮一般要生长15～20年以上才符合药用质量要求，药材生产周期很长。而现今厚朴主要是靠砍树剥皮，因此，药用厚朴与环境生态保护产生很大的矛盾[3]。为满足对厚朴不断增大的需求量，现已大力发展厚朴种植[4]。除此之外，寻找开发厚朴替代品也是满足厚朴需求的途径。国内大量厚朴叶未加利用，任其凋落腐烂，经前人研究表明厚朴叶含有厚朴的主要有效成分[5]。本研究通过急性毒性实验，小鼠骨髓微核实验，小鼠精子畸形实验，大鼠30 d喂养实验，进一步探寻厚朴叶的毒性作用，和与已经入药的厚朴皮、厚朴花毒性比较，以期实现厚朴资源的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品

厚朴叶和厚朴皮、厚朴花（购自井冈山，经井冈山大学生药实验室鉴定）；Giemsa染液（购于上海江莱生物科技有限公司）；环磷酰胺试剂（规格：50 mL/瓶，编号：0703210-L，购于上海然泰生物有限公司）；HE染液（规格；500 mL/ 瓶，编号：070024-H，购于北京博润莱特科技有限公司）。

1.1.2 实验动物

昆明种小鼠（SPF级，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2011-0003），SD大鼠（购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SCXK（湘）2001-0018）。

1.1.3 仪器

中药材粉碎机（型号S—L250），旋转蒸发仪（郑州亚荣仪器有限公司，型号 RE—2000A），动物天平（型号 ZX—2007，购与上海台衡仪器仪表有限公司），生物显微镜（型号CX21，购与于国华电器有限公司），分析天平（型号EMB200-3V，购于上海岛韩实业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 厚朴叶和厚朴皮、厚朴花水煎液的制备

取经过初步粉碎后的药物，加8倍的蒸馏水浸泡1 h后，煎煮30 min，倒出煎液；再加4倍的蒸馏水，煎煮20 min，重复后面步骤1次；合并3次煎液，四层纱布过滤后，用旋转挥发仪蒸干成浸膏状待用。用蒸馏水配成以下所需的药物浓度（生药浓度）。

1.2.2 急性毒性试验

昆明种小鼠60只，雌、雄各半，体重(18～22) g。动物购进后，先适应性喂养 3 d，然后开始实验，于实验前禁食16 h，不限饮水。根据最大耐受剂量法[6-7]， 受试样品剂量设置为20 g/kg。实验分为厚朴皮、厚朴叶、厚朴花三组。把厚朴皮、厚朴叶、厚朴花配成2 g/mL，灌胃体积均为10 ml/kg，累积剂量为20 g/kg。记录动物的中毒表现及死亡情况，连续观察14 d，实验结束解剖动物进行大体观察。按毒性分级标准评价受试物的急性毒性强弱。

1.2.3 骨髓微核试验

昆明种小鼠70只，雌、雄各半，体重(25～30) g。按体重随机分为7组，每组10只。第1～3组为厚朴叶剂量组，剂量分别为10、5、2.5g/kg；第4组为阴性对照组（给蒸馏水）；第 5组为阳性对照组（给环磷酰胺0.04 g/kg）；第6～7组为厚朴皮、厚朴花组，剂量为10 g/kg。厚朴叶水煎液用蒸馏水配制，浓度分别为1.0、0.5、0.25 g/mL，厚朴皮、厚朴花水煎液浓度分别为1.0 g/mL，环磷酰胺浓度为40 mg/mL，灌胃量都为10 mL/kg。根据30 h给受试物法[6-7]，各组分别间隔24 h给两次药物，于第二次灌胃6 h后颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，用1.0 mL生理盐水冲出骨髓液，离心收集骨髓液，常规涂片。涂片干燥后放入甲醇中固定5～10 min。将固定好的涂片放入 Giemsa染液应用液中染色 10～15 min。立即用 pH6.8的磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液配制方法为：将磷酸二氢钾4.5 g和磷酸二氢钠11.81 g，加至1000 mL蒸馏水中。）冲洗、晾干、阅片。每鼠计数多个高倍视野下 1000个左右的嗜多染红细胞，记录含微核细胞数、微核发生率（微核数与嗜多染红细胞比值），每鼠记数至少 10～20个高倍视野下的嗜多染红细胞和成熟红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值。

1.2.4 小鼠精子畸形试验

雄性昆明种小鼠56只，体重(25～35) g。随机分为7组，每组8只。分组及给药同小鼠骨髓微核实验，每天灌胃1次，连续5 d，于第35 d，颈椎脱臼处死小鼠，取两侧副睾，放入盛有l mL生理盐水的小烧杯中，用眼科剪将副睾纵向剪2～3刀，静止1～3 min，轻轻摇动。用四层擦镜纸过滤，吸滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定10 min，干燥，用1.5%伊红染色l.0 h，用水轻冲，干燥，镜检。每鼠计数多个高倍视野下1000条左右的精子，计数各组精子畸变数及畸变类型，计算精子畸变率(%)，畸变率为畸形精子与正常精子的比例[6-7]。

1.2.5 大鼠30 d喂养实验

选用SD大鼠120只，雌、雄各半，体重(60～90)g，饲养室温度：(20～25) ℃，相对湿度：40%～70%。按体重随机分为6组，每组20只，雌雄各半。根据中药的人体推荐用量，厚朴叶设15、7.5、3.75 g/kg三个剂量组，分别相当于人用剂量的 100、50、25倍，另设厚朴皮和厚朴花剂量组，都为 7.5 g/kg，和一个正常组（阴性对照组，给予蒸馏水）。用蒸馏水将厚朴叶水煎液配制成1.5、0.75、0.375 g/mL，厚朴皮、厚朴花水煎液配成0.75 g/mL按10 mL/kg的体积给相应剂量组动物灌胃，阴性对照组给等量的蒸馏水，每天灌胃1次。大鼠单笼饲养，自由饮水和进食。每周称重1次，称饲料剩余量2次。每天观察动物的一般状况、有无中毒表现和死亡。实验结束处死大鼠，进行指标检测，观察指标如下[6,8]：

每周进食量、体量、计算总的食物利用率（每摄入100 g饲料的体重增长克数）。

血常规指标：白细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、血红蛋白、红细胞数、平均红细胞体积、血小板数。

血液生化指标：肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血糖、天门冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶。

脏体系数：实验结束前称体质量，处死动物后，取肝、肾、脾、睾丸、卵巢称湿重，计算相应的脏体比。脏体比的计算方法为脏器重量/体重×100。

病理组织学检查：实验结束处死动物，取心、肺、肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢等脏器进行病理组织学检查。

1.2.6 统计学方法

2 结果

2.1 急性毒性试验结果

厚朴叶水煎液20 g/kg剂量给小鼠灌胃给药1次，观察14 d，未出现中毒症状和死亡。根据毒性分级标准，厚朴叶属于无毒级。对照品厚朴皮、厚朴花水煎液按照同样的方法试验，结果也是属于无毒级。厚朴叶和厚朴皮、厚朴花的急性毒性无差异。

2.2 骨髓微核试验结果

厚朴叶水煎液剂量分别为10、5、2.5 g/kg，给药两次后，微核发生率和嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值，与正常组比较无差异，说明厚朴叶水煎液在此剂量下无致骨髓细胞突变作用。厚朴皮、厚朴花水煎液按照剂量为 10 g/kg，同样的方法做实验，也无致骨髓细胞突变作用。而阳性对照药物环磷酰胺有明显的至突变作用。厚朴叶和厚朴皮、厚朴花的无致骨髓细胞突变毒性无差异。具体结果见表1。

表1 厚朴叶及厚朴皮、厚朴花对骨髓微核发生率的影响（ , n=10）Table 1 Magnolia officinalis leaves, bark and flower on bone marrow micronucleus incidence in mice

表1 厚朴叶及厚朴皮、厚朴花对骨髓微核发生率的影响（ , n=10）Table 1 Magnolia officinalis leaves, bark and flower on bone marrow micronucleus incidence in mice

**P ＜ 0.01，与正常组比较。

组别 微核发生率(%) 嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值正常组(阴性对照组) 0.94 ± 0.43 0.98 ± 0.10环磷酰胺 0.04 g/kg 组 8.50 ±1.85** 0.97 ± 0.05厚朴皮 10 g/kg 组 0.96 ± 0.17 1.01 ± 0.14厚朴花 10 g/kg 组 0.95 ± 0.32 0.99 ± 0.03厚朴叶 10 g/kg 组 1.08 ± 0.45 0.97 ± 0.07厚朴叶 5 g/kg 组 0.94 ± 0.41 0.97 ± 0.12厚朴叶 2.5 g/kg 组 0.93 ± 0.52 0.98 ± 0.11

2.3 小鼠精子畸形试验结果

厚朴叶水煎液剂量分别为10、5、2.5 g/kg，给药5 d后，精子畸变率与正常组比较无差异，说明厚朴叶水煎液在10、5、2.5 g/kg剂量下无生殖细胞毒性。厚朴皮、厚朴花水煎液按照剂量为10 g/kg，同样的方法做，也无生殖细胞毒性。而阳性对照药物环磷酰胺有明显的至精子畸形作用。厚朴叶和厚朴皮、厚朴花的无生殖细胞毒性无差异。具体结果见表2。

表2 厚朴叶及厚朴皮、厚朴花对小鼠精子畸变率的影响（ ，n= 8）Table 2 Magnolia officinalis leaves, bark and flower of sperm abnormality rate in mice

表2 厚朴叶及厚朴皮、厚朴花对小鼠精子畸变率的影响（ ，n= 8）Table 2 Magnolia officinalis leaves, bark and flower of sperm abnormality rate in mice

**P ＜ 0.01，与正常组比较。畸变类型包括胖头，无钩，香蕉形，尾折叠，双尾，双头。其中以无钩居多。

组别 精子畸变率(%)正常组（阴性对照组） 2.11 ± 0.18环磷酰胺0.04 g/kg组 12.89 ± 1.75**厚朴皮10 g/kg组 2.03 ± 0.05厚朴花10 g/kg组 2.01 ± 0.06厚朴叶10 g/kg组 1.97 ± 0.20厚朴叶5 g/kg组 2.08 ± 0.27厚朴叶2.5 g/kg组 1.99 ± 0.31

2.4 大鼠30 d喂养实验结果

2.4.1 食物利用率

对雄性大鼠厚朴叶低剂量组、厚朴皮组、厚朴花组在第2周都降低了食物利用率，厚朴皮组、厚朴花组在第3周也降低了食物利用率。厚朴皮组在第4周出现了一只大鼠体重明显下降。对雌性大鼠厚朴叶中、低剂量组、厚朴皮组、厚朴花组在第 2周都提高了食物利用率。具体结果见表3和表4。

表3 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对雄性大鼠食物利用率的影响（，n = 10，g/100 g饲料）Table 3 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect food utilization in male rats

表3 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对雄性大鼠食物利用率的影响（，n = 10，g/100 g饲料）Table 3 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect food utilization in male rats

注：&出现了一只大鼠体重明显下降。* P ＜ 0.05，** P ＜ 0.01，与正常组比较。

分组 正常组 厚朴叶15 g/kg组 厚朴叶7.5 g/kg组 厚朴叶3.75 g/kg组 厚朴皮7.5 g/kg组 厚朴花7.5 g/kg组第 1 周 22.39 ± 4.37 22.89 ± 3.36 26.46 ± 2.13 26.58 ± 5.18 24.91 ± 2.95 25.29 ± 1.65第 2 周 22.14 ± 1.32 19.39 ± 3.28 19.53 ± 2.27 17.07 ± 1.02** 11.55 ± 1.85** 17.47 ± 2.71*第 3 周 19.26 ± 2.15 18.56 ± 7.43 20.77 ± 1.69 21.19 ± 4.11 15.56 ± 4.11* 15.60 ± 3.15*第 4 周 20.37 ± 5.64 22.39 ± 5.62 22.40 ± 3.65 21.83 ± 2.93 1.90 ± 27.18& 18.47 ± 3.42

表4 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对雌性大鼠食物利用率的影响（，n = 10, g/100 g饲料）Table 4 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect food utilization in female rats

表4 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对雌性大鼠食物利用率的影响（，n = 10, g/100 g饲料）Table 4 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect food utilization in female rats

注： * P ＜ 0.05，与正常组比较。

分组 正常组 厚朴叶15 g/kg组 厚朴叶7.5 g/kg组 厚朴叶3.75 g/kg组 厚朴皮7.5 g/kg组 厚朴花7.5 g/kg组第 1 周 20.53 ± 4.75 16.18 ± 2.65 17.66 ± 2.59 21.89 ± 6.20 19.84 ± 3.03 19.52 ± 5.76第 2 周 20.70 ± 1.68 24.08 ± 4.93 28.53 ± 3.48* 31.48 ± 8.84* 28.83 ± 4.04* 29.27 ± 6.17*第 3 周 20.78 ± 4.27 20.59 ± 2.65 20.19 ± 3.03 20.29 ± 6.62 22.98 ± 4.95 22.43 ± 5.09第 4 周 19.12 ± 3.51 19.98 ± 3.76 20.12 ± 4.35 18.99 ± 3.79 19.03 ± 2.16 19.77 ± 3.45

2.4.2 血常规指标

厚朴叶高剂量组有1例白细胞减少；厚朴叶中剂量组可以增加淋巴细胞数；厚朴叶低剂量组升高白细胞、淋巴细胞和降低红细胞数、血红蛋白、红细胞压积；其它与正常组比较无差异。厚朴皮与厚朴花组不影响血常规。具体结果见表5。

表5 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对大鼠血常规的影响（ s，n= 20）Table 5 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect routine blood in rats

表5 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对大鼠血常规的影响（ s，n= 20）Table 5 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect routine blood in rats

注：* P ＜ 0.05，与正常组比较。

分组 正常组 厚朴叶15 g/kg组 厚朴叶7.5 g/kg组 厚朴叶3.75 g/kg组 厚朴皮7.5 g/kg组 厚朴花7.5 g/kg组白细胞(109 /L) 4.86 ± 0.99 5.08 ± 1.45 6.54 ± 1.62 7.73 ± 2.25* 5.16 ± 1.86 5.18 ± 0.99中性粒细胞(109 /L) 1.10 ± 0.39 0.83 ± 0.18 1.34 ± 0.51 1.27 ± 0.51 1.11 ± 0.59 1.15 ± 0.44淋巴细胞(109 /L) 3.58 ± 0.66 4.12 ± 1.33 5.00 ± 1.12* 6.25 ± 1.99* 3.89 ± 1.29 3.86 ± 0.74单核细胞(109 /L) 0.126 ± 0.078 0.102 ± 0.034 0.13 ± 0.060 0.145 ± 0.046 0.114 ± 0.069 0.123 ± 0.077嗜酸性粒细胞(109 /L) 0.044 ± 0.009 0.034 ± 0.011 0.040 ± 0.020 0.058 ± 0.034 0.040 ± 0.020 0.043 ± 0.019嗜碱性粒细胞(109 /L) 0.006 ± 0.005 0.003 ± 0.004 0.004 ± 0.005 0.009 ± 0.011 0.001 ± 0.004 0.007 ± 0.008红细胞(1012 /L) 7.38 ± 0.59 6.80 ± 0.50 7.15 ± 0.83 6.71 ± 0.37* 7.03 ± 0.70 7.21 ± 0.60血红蛋白(g L) 146.80 ± 8.93 136.88 ± 9.03 143.57 ± 11.38 135.88 ± 5.22* 140.43 ± 9.23 141.50 ± 7.79红细胞平均体积(fL) 56.70 ± 1.83 55.80 ± 1.44 54.80 ± 2.00 55.17 ± 1.44 54.51 ± 2.39 54.35 ± 1.61红细胞压积（%） 41.86 ± 3.94 37.98 ± 3.29 39.07 ± 3.63 36.99 ± 1.72* 38.24 ± 2.93 39.13 ± 2.29血小板(109 /L) 828.60 ± 61.57 820.50 ± 102.53 790.86 ± 114.05 815.38 ± 87.48 831.14 ± 127.29 886.33 ± 82.72

2.4.3 血生化指标

厚朴叶高剂量组与正常组比较可以降低血清肌酐含量；厚朴叶中剂量组有4例肌酐异常升高；厚朴叶低剂量组有4例肌酐异常升高；厚朴皮组有4例肌酐异常升高，可以降低尿素氮；厚朴花组有3例肌酐异常升高，可以降低尿素氮；其它没有差异。厚朴叶各剂量组及厚朴皮组、厚朴花组对血液中总蛋白、球蛋白、总胆固醇、甘油三酯、丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶、葡萄糖无影响。具体结果见表6。

表6 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对大鼠肾功能的影响（s, n = 20)Table 6 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect renal function in rats

表6 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对大鼠肾功能的影响（s, n = 20)Table 6 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect renal function in rats

注：* P ＜ 0.05，与正常组比较。

分组 正常组 厚朴叶15 g/kg组 厚朴叶7.5 g/kg组 厚朴叶3.75 g/kg组 厚朴皮7.5 g/kg组 厚朴花7.5 g/kg组尿素氮(mmol / L) 7.97 ± 1.28 7.52 ± 1.56 7.59 ± 1.03 7.50 ± 1.81 6.75 ± 0.36* 6.80 ± 0.71*肌酐(umol / L) 25.22 ± 4.89 19.50 ± 4.00* 150.10 ± 161.29* 123.88 ± 111.78* 111.78 ± 99.95* 144.14 ± 212.38*

2.4.4 脏体系数

对于雄鼠，厚朴叶各剂量组、厚朴皮组、厚朴花组可降低肝的脏体系数；厚朴叶低剂量组、厚朴皮组、厚朴花组还可降低睾丸的脏体系数；厚朴皮组还出现了一例睾丸重量异常低。对于雌鼠，厚朴叶高低剂量组、厚朴皮组可降低卵巢脏体系数。具体结果见表7。

表7 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对大鼠脏体系数的影响（，n=10，脏器重量/体重×100）Table 7 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect organs and body weight ratio in rats

表7 厚朴叶、厚朴皮和厚朴花对大鼠脏体系数的影响（，n=10，脏器重量/体重×100）Table 7 Magnolia officinalis leaves, bark and flower affect organs and body weight ratio in rats

注：* P ＜ 0.05，* *P ＜ 0.01，与正常组比较，&有1例睾丸重量异常低。

分组 正常组 厚朴叶15 g/kg组 厚朴叶7.5 g/kg组 厚朴叶3.75 g/kg组 厚朴皮7.5 g/kg组 厚朴花7.5 g/kg组肝 4.41 ± 0.25 3.60 ± 0.22** 3.66 ± 0.41* 3.84 ± 0.15** 3.90 ± 0.08* 3.58 ± 0.31**雄鼠肾 0.40 ± 0.04 0.39 ± 0.01 0.42 ± 0.02 0.37 ± 0.03 0.41 ± 0.02 0.36 ± 0.02脾 0.20 ± 0.02 0.19 ± 0.02 0.19 ± 0.01 0.20 ± 0.02 0.19 ± 0.01 0.19 ± 0.02睾丸 0.43 ± 0.02 0.42 ± 0.04 0.42 ± 0.03 0.37 ± 0.01** 0.28 ± 0.16*& 0.35 ± 0.02**雌鼠肝 4.27 ± 0.37 4.56 ± 0.17 4.17 ± 0.36 4.20 ± 0.15 4.28 ± 0.19 4.01 ± 0.61肾 0.39 ± 0.02 0.42 ± 0.02 0.39 ± 0.02 0.41 ± 0.04 0.39 ± 0.01 0.39 ± 0.02脾 0.24 ± 0.02 0.24 ± 0.02 0.24 ± 0.01 0.25 ± 0.04 0.22 ± 0.03 0.25 ± 0.01卵巢 0.08 ± 0.01 0.06 ± 0.00* 0.07 ± 0.01 0.06 ± 0.01* 0.066 ± 0.00* 0.07 ± 0.01

2.4.5 病理组织学检查

对大鼠心、肺、肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢等脏器进行病理组织学检查，未见明显异常。

3 讨论

厚朴作为常用中药，我国历代主要本草所载正品厚朴其药用部位均为树皮，古今均未见有叶入药的记载。厚朴生长周期长，一般要生长 15年以上才能砍树剥皮供药用。全国厚朴种植面积很大，厚朴叶资源十分丰富，而且每年可以再生，现今国内大量厚朴叶未加以利用，任其凋落腐烂，造成资源的浪费。如能将叶开发利用，将有利于厚朴药材资源的综合利用和可持续利用。根据同种植物不同部位可能含有相同或相似的化学成分，具有相似的药效和临床疗效[9]，我们对厚朴叶进行了急性毒性实验、骨髓微核实验、精子畸形实验及慢性毒性实验，以探讨厚朴叶的毒性和与已经入药的厚朴皮、厚朴花毒性比较，为其进一步开发为药物提供一定的参考依据。

通过以上实验，我们可以得知厚朴叶是无急性毒性，无致骨髓突变毒性作用，无致精子畸形毒性作用，有慢性毒性作用。慢性毒性主要表现在影响食物利用率、血常规、肾功能、睾丸和卵巢的发育方面。厚朴叶与厚朴皮及厚朴花毒性的比较，其差异主要在厚朴叶会影响血常规，而厚朴皮及厚朴花不影响血常规，其他方面无差异。对厚朴叶的开发利用，可以综合地从药效、毒性和药动学等多方面来研究。就毒性研究而言，虽然民间认为中药的毒性没有西药那么明显[10-11]，但对中药或可发展为中药的物质，还应该进行更长期的、更广泛的毒性研究。

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