Mn、Zn单一及复合污染对水蓼氮素代谢的影响

刘华，刘可慧，周振明,，苏银萍，陈孟林,，陈朝述,，于方明,*

1. 广西师范大学环境与资源学院，广西 桂林 541004；2. 桂林电子科技大学生命与环境学院，广西 桂林 541004；3. 广西环境污染控制与技术重点实验室，广西 桂林 541004

Mn、Zn单一及复合污染对水蓼氮素代谢的影响

刘华1，刘可慧2，周振明1,3，苏银萍1，陈孟林1,3，陈朝述1,3，于方明1,3*

1. 广西师范大学环境与资源学院，广西 桂林 541004；2. 桂林电子科技大学生命与环境学院，广西 桂林 541004；3. 广西环境污染控制与技术重点实验室，广西 桂林 541004

采用水培的方法，研究了Mn、Zn单一及复合污染对锰超富集植物水蓼(Polygonum hydropiper L.)生长、氮代谢关键酶（谷氨酰胺合酶(GOGAT)、谷氨酸合成酶(GS)、硝酸还原酶(NR)、谷氨酸脱氢酶(GDH））活性以及硝态氮（NO3-）、铵态氮（NH4+）、可溶性蛋白质、游离脯氨酸、叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b含量，水蓼对Mn、Zn的吸收和转移系数的影响。研究结果表明，水蓼根、茎、叶中Mn、Zn含量，随着Mn、Zn处理浓度的增加而增加，且水蓼对Zn和Mn的转移系数分别维持在1.0～1.8和1.0～11.9，表明Zn对水蓼体内Mn的转移影响较为明显；Mn/Zn单一及复合处理显著降低了水蓼叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b的含量（P<0.05），但是叶绿素a/b较对照组显著提高（P<0.05），Mn/Zn复合处理抑制了根系生长及株重，T8时，根长仅为对照组的64.93%，而T9时，株重仅为对照组的65.45%；单Zn及Mn/Zn复合处理均降低了水蓼根系中NO3-的含量，以及抑制NR活性，T5时，叶片和根中NR活性分别是对照组的44.36%和34.41%，但提高了叶片与根系中NH4+的含量，T9时叶片中的NH4+含量是对照组的2.35倍，T8时根中的NH4+含量是对照组的1.58倍，以及增加了GS活性，T9时，叶和根中GS活性分别使对照组的1.32和1.57倍，Zn及Mn、Zn复合处理对水蓼叶片与根系中可溶性蛋白质含量无显著影响（P>0.05），表明GS活性以及GDH活性提高在消除NH4+胁迫过程中起重要作用。

Mn/Zn复合污染；水蓼；氮素代谢

Mn和Zn作为动植物生长所必须的营养元素，与300多种酶的活性有关，参与细胞的所有代谢过程，在维持动植物生长中起着重要的作用（刘欣等，2005），Mn在植物光合作用中起着重要作用，但是高Mn将会抑制植物的光合作用，高含量的Mn抑制植物根系的伸长（臧小平，1999），Zn与植物的碳水化合物的转化过程、光合作用密切相连，高Zn将抑制植物的生物量；高含量的Mn和Zn能抑制神经末梢释放神经递质，导致人体神经系统失调，引起帕金森综合症及头晕、呕吐、腹泻等症状（曹永孝等，1993；Zhang等，2011）。广西Mn矿含量丰富，开采量居全国之首位，但是大量的 Mn矿开采，导致矿区周围Mn污染严重，同时还伴随着中强度的Zn污染（黄芳芳，2011）。因此寻找适合本地的锰污染土壤修复治理的方法显得尤为紧迫和必要。在众多重金属污染土壤修复技术中植物修复因其具有绿色环保和低成本的特点而倍受关注，并越来越多的应用于污染土壤的修复（Liu等，2009；Abdolkarimc等，2011；Zhang等，2011）。

水蓼是国内较早发现的Mn超富集植物之一，其对Mn具有较强的富集性、累积性和耐性，是一种良好的Mn污染土壤修复材料，在广西也分布广泛，但目前对其的研究主要集中在其对Mn的富集特征（王华等，2007）、Mn在植物体中的分布（王华等，2008）及Mn对抗氧化机理（于方明等，2011）的影响上。而重金属复合污染对其生理特征的影响还未见报道。因此，本研究采用水培方式，探讨了Mn、Zn及其交互作用对水蓼生长，Mn、Zn吸收，及氮素代谢途径的影响，旨在为水蓼的实际应用提供理论依据。

1 实验材料和方法

1.1 植物培养

供试植物水蓼幼苗采自漓江沿岸。将所采集的水蓼幼苗用自来水冲洗干净后采用1/2Hoagland营养液进行预培养，Hoagland营养液组成为：2.0 mmol·L-1Ca(NO3)2.4H2O，0.10 mmol·L-1KH2PO4，0.50 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.10 mmol·L-1KCl，0.70 mmol·L-1K2SO4，0.10 μmol·L-1H3BO3，0.50 μmol·L-1MnSO4·H2O，0.50 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.20 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.01 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24，0.10 mmol·L-1Fe-EDTA。幼苗生长至一定高度后截取上端5 cm长的带叶枝条进行第2次预培养，待枝条长出比较旺盛的根系后，选取生长一致的植株，移至装有 1/2 Hoagland营养液的黑色塑料盆（34 cm×22 cm ×11 cm，长×宽×高）中，然后加Mn处理，每盆种9株，培养溶液体积为4 L。采用正交法设置了3个不同浓度的Mn和Zn，共计9个处理浓度（见表1），其中Mn以MnSO4·H2O，Zn以ZnSO4·H2O的形式加入到1/2 Hoagland营养液中，每个处理设3个重复，营养液每3 d更换1次，并用0.1 mol·L-1HCl或NaOH调节pH至5.7左右，培养室温度为 20～25 ℃，空气相对湿度为60%～70%，人工光照14 h，营养液保持24 h连续通气，处理15 d后收获。

表1 锰和锌的处理浓度设置Table 1 Treated concentrations of Mn and Zn mg·L-1

1.2 试验方法

1.2.1 生物量测定

将植株样品用自来水冲洗净，然后将根浸入20 mmol·L-1EDTA-Na2溶液中交换20 min，以去除根系表面吸附的Mn2+，最后用去离子水洗净，吸水纸吸干表面水分，用卷尺分别测量株高和根长并称鲜重。随后将植物样品的根和叶片分为两部分，其中一部分装入封口密封带，放入-20 ℃冰箱保存备用；另一部分植物样品放至烘箱内，在 105 ℃下杀青30 min，然后在70 ℃下烘48 h至恒重，用不锈钢粉碎机磨碎，过60目尼龙网筛用于Mn、Zn含量测定。

1.2.2 NR、GS、GDH和GOGAT酶测定

NR、GS、GDH的测定参照《现代植物生理学实验指南》的方法（中国科学院上海植物生理研究所，1999）。NR以1 h内还原KNO3生成NO2-的μg表示酶活性，GS活性以1 h内形成1 μmol γ-谷氨酰基羟肟酸的酶量作为1个酶活性单位，GDH活性以NADH μmol·min-1·g-1蛋白质表示。GOGAT的测定参照Sánchez（Sánchez等，2004）的方法，以每分钟反应液减少1 μmol的NADH所需的酶量定义为1个酶活性单位。以上酶的提取和测定均在0～4 ℃条件下完成。

1.2.3 NO3-、NH4+、可溶性蛋白质和游离脯氨酸和叶绿素含量测定

叶绿素、NO3-、NH4+和游离脯氨酸含量的测定参照王学奎（王学奎，2006）的方法，可溶性蛋白质的含量参照含量测定Bradford（Bradford，1976）的方法测定，使用牛血清蛋白制作标准曲线。

1.2.4 Mn和Zn的测定

称取0.50 g烘干且磨碎的水蓼样品于100 mL三角瓶中，加入HNO3-HClO4（两者体积比为4∶1），消煮至澄清，用去离子水定容后采用原子吸收分光光度计（日立180-80型）测定各植物样品中Mn和Zn的含量。

1.2.5 转移系数（transfer factor, TF）的计算

转移系数（TF）=地上部分所累积的重金属含量(mg·kg-1)/根部所累积的重金属含量(mg·kg-1)

以上所有测定至少重复 3次，所得数据用excel2003和SPSS 17.0软件处理，应用Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果分析

2.1 水蓼对Mn/Zn单一及复合污染的吸收累积及转运系数

如表2所示，当Mn浓度一定时，根、茎、叶中Zn含量随着Zn处理浓度的增加而增加，而Mn的含量则随着Zn浓度的增加而降低。而Zn浓度一定时，根、茎、叶中Mn的的含量均随着Mn浓度的增加而呈现上升的趋势。Mn、Zn单一处理及交互作用下，水蓼对Zn的转移系数影响不明显，维持在1.0～1.8，而对Mn的转移系数维持在1.0～11.9之间，表明Zn对Mn的转移影响较为明显。

2.2 Mn/Zn对水蓼生长和光合色素的影响

从表3中可以看出，在Mn、Zn单一及复合处理处理下，对水蓼影响最大的为根长和株重。100 mg·L-1Mn处理（T3）及Mn、Zn复合处理（T5，T6，T7，T8）均显著降低了水蓼的株重和根长（P<0.05），表明Mn、Zn对水蓼的株重和根长最为明显，对株高的影响均较小。与水蓼生物量相比，Mn/Zn单一及复合污染对水蓼光合色素的影响更为明显。Mn/Zn单一及复合污染显著抵制了水蓼的叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素a+b的含量（P<0.05）。叶绿素a/b维持在2.3～3.2之间，并以T1处理最低，说明复合污染对叶绿素b的影响更大。单Mn或者单Zn处理对水蓼类胡萝卜素影响不显著（P>0.05）。

表2 Mn、Zn单一及复合污染对水蓼的累积和转移系数Table 2 Accumulation and transfer factors on Mn or Zn in the P. hydropiper L.

表3 Mn、Zn单一及复合污染对水蓼生长和叶光合色素的影响Table 3 Effects of Mn/Zn simple and combined pollution on plant growth and photosynthetic pigments of P. hydropiper L.

2.3 Mn、Zn单一及复合污染对水蓼NO3-、NH4+、游离脯氨酸和可溶性蛋白质的影响

如表4所示，单Zn处理降低了水蓼叶片与根系中NO3-的含量，根系中NO3-的含量在10 mg·L-1的单Mn处理时，显著高于100 mg·L-1处理，而叶片中却最低。Mn、Zn复合处理降低了根系中NO3-含量，而100 mg·L-1的Mn、Zn复合处理叶片中NO3-的含量显著高于其他处理（P<0.05）。Mn、Zn处理提高了叶片与根系中 NH4+的含量，在单 Zn、Mn处理下，叶片与根系中NH4+的含量随着处理浓度的增加而增加。在Mn处理浓度一定时，根系中游离脯氨酸的含量随着Zn处理浓度的增加而降低，而在叶片中则表现为在Zn处理浓度为10 mg·L-1时，含量最低。水蓼叶片与根系中可溶性蛋白质含量在Mn、Zn单一及复合污染下，与对照间均无显著性差异（P>0.05）。

表4 Mn/Zn复合污染对对水蓼NO3-、NH4+、游离脯氨酸和可溶性蛋白质的影响Table 4 Effects of Mn/Zn simple and combined pollution on NO3-, NH4+, free proline and soluble protein on P. hydropiper L.

表5 Mn、Zn单一及复合污染对对水蓼氮代谢关键酶的影响Table 5 Effects of Mn/Zn simple and combined pollution on activities of key enzymes of nitrogen metabolism on P. hydropiper L.

2.4 Mn/Zn单一及复合污染对水蓼氮代谢关键酶的影响

从表5中可以看出，Mn、Zn添加降低了水蓼叶片和根系中GOGAT、NR活性。但Zn处理增加了根系中NR活性，且Zn处理浓度越高，活性越高，单Mn处理则降低了根系NR活性。Mn、Zn单一及复合处理显著提高了叶片与根系中 GS活性。叶片中GDH的活性变化与叶片中的NO3-和游离脯氨酸的变化趋势相似。低浓度的Mn/Zn复合污染可以提高GDH的活性，但高浓度（T9）的Mn/Zn处理严重的抵制了该酶的活性。

3 讨论

叶绿素是光合作用的物质基础，其含量高低将直接影响植物光合作用的强弱及物质合成速率的高低（寇士伟等，2011）。本研究结果表明，Mn、Zn单一及复合处理显著抑制了水蓼叶绿素a、b和a+b的含量（P<0.05），叶绿素含量的降低将直接影响植物光合作用及物质的合成，导致生物量的降低，水蓼在Mn、Zn处理下植物根系生长受到了抑制、株重显著降低，这与叶绿素含量降低有直接的关系。该结果与刘萍对Pb和Cd复合污染下柠檬酸对龙葵生长的影响研究结果相似（刘萍等，2012）。叶绿素含量降低可能是因为Mn和Zn进入植物组织中后，Mn、Zn与细胞膜上的蛋白体结合，导致基粒垛叠结构解体，引起叶绿素的降解（于方明等，2008），另外，本研究中发现，水蓼根、茎、叶中Mn、Zn含量均随着Mn、Zn处理浓度的增加而增加，植物组织中大量的Mn、Zn存在，有可能替代了植物色素中的 Mg，引起蛋白质变性。这两种原因将最终导致水蓼光合作用受阻，影响水蓼物质的合成，从而降低植物的生物量。

植物能够从土壤中吸收的氮源主要有 NO3-和NH4+，但其的转化主要通过NR及GOGAT、GS来完成，因此NR以及GOGAT、GS被称为植物氮素转化的关键酶。本研究结果表明，单Zn及Mn、Zn复合处理均降低了水蓼叶片与根系中NO3-的含量，此时，叶片与根系中NR活性NO3-的含量变化相似，都显著低于对照，根系中NO3-含量较低可能是由于水蓼体中高浓的Mn、Zn抑制了NO3-的吸收，同时抑制了NR活性。本研究还发现，Mn、Zn处理提高了叶片与根系中NH4+的含量，在单Zn、Mn处理下，叶片与根系中NH4+的含量随着处理浓度的增加而增加，表明Mn、Zn处理造成了水蓼NH4+的胁迫。此时植物可以通过提高 GOGAT/GS循环相关酶以及GDH活性来消除NH4+的胁迫，这与本实验的研究结果水蓼根系中GS活性以及GDH活性在Mn、Zn处理下得到不同程度的升高的结果一直，表明GS活性以及GDH活性在消除NH4+胁迫的过程中起重要作用。另外Mn、Zn单一及复合处理，水蓼叶片与根系中蛋白质含量均与对照间无显著性差异的结果也证明，GS活性以及GDH活性提高有力的消除了NH4+胁迫。

4 结论

Mn/Zn单一及复合处理降低了水蓼叶绿素a、叶绿素 b和叶绿素（a+b）的含量，抑制了水蓼根系的生长以及株重；水蓼根茎叶中Mn、Zn含量随着Mn、Zn处理浓度的增加而增加，Mn、Zn含量的增加抑制了水蓼对NO3-的吸收，同时造成了叶片与根系中不同程度的NH4+胁迫，GS与GDH活性不同程度的增加有效降低了NH4+胁迫。

ABDOLKARIM C, MITRA N, HOSSERIN L Y. 2009. Phytoremediation of heavy-metal-polluted soils: Screening for new accumulator plants in Angouran mine (Iran) and evaluation of removal ability[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 72(5): 1349-1353.

BRADFORD M. 1976. A rapid method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 72(1): 248-254.

LIU Z L, HE X Y, CHEN W, et al. 2009. Accumulation and tolerance characteristics of cadmium in a potential hyperaccumulator-Lonicera japonica Thunb[J]. Journal of Hazardous Materials, 169(1-3): 170-175.

SĂNCHEZ E, RIVERO R M, RUIZ J M, et al. 2004. Changes in biomass, enzymatic activity and proteinconcentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3application rates[J]. Scientia Horticulturae, 99(3-4): 237-248.

ZHANG X F, XIA H P, LI Z, et al. 2011. Identification of a new potential Cd-hyperaccumulator Solanum photeinocarpum by soil seed bank-metal concentration gradient method[J]. Journal of Hazardous Materials, 189(1-2): 414-419.

曹永孝, 车锡平, 李卫红, 等. 1993. 铜、锌、锰对突触的抑制作用[J]. 中国药理学报, 9(6): 431-434.

黄芳芳. 2011. 广西桂平锰矿露采矿区的生态环境与治理修复研究[D].桂林: 广西师范大学: 31-40.

寇士伟, 倪高风, 马岚婷, 等. 2011. Cd-Pb-Cu复合污染对芥菜生长及生理特性的影响[J]. 环境科学研究, 24(3): 281-286.

刘萍, 翟崇治, 余家燕, 等. 2012. Cd、Pb复合污染下柠檬酸对龙葵修复效率及抗氧化酶的影响[J]. 环境工程学报, 6(4): 1387-1392.

刘欣, 刘瑾, 徐红颖. 2005. 锌分析测定方法的研究及其进展[J]. 华北煤炭医学院学报, 7(5): 575-577.

王华, 唐树梅, 廖香俊, 等. 2007. 锰超积累植物——水蓼[J]. 生态环境, 16(3): 830-834.

王华, 唐树梅, 廖香俊, 等. 2008. 超积累植物水蓼吸收Mn的生理与分子机制[J]. 云南植物研究, 30(4): 489-495.

王学奎. 2006. 植物生理生化实验原理和技术(第二版)[M]. 北京: 高等教育出版社: 122-123, 199-201, 278-279.

于方明, 仇荣亮, 汤叶涛, 等. 2008. Cd对小白菜生长及氮素代谢的影响研究[J]. 环境科学, 2(29): 506-511.

于方明, 李燕, 刘可慧, 等. 2011. Mn对超富集植物短毛蓼和水蓼生长、Mn吸收及氮素代谢的影响[J]. 环境科学学报, 31(8): 1783-1789.

臧小平. 1999. 土壤锰毒与植物锰的毒害[J]. 土壤通报, 30(3): 139-141.

中国科学院上海植物生理研究所. 1999. 现代植物生理学实验指南[M].北京: 科学出版社: 152-154, 156-158.

Effects of Mn/Zn Single and Combined Pollution on the Nitrogen Metabolism in Polygonum Hydropiper L.

LIU Hua1, LIU Kehui2, ZHOU Zhenming1,3, SU Yinping1, CHEN Menglin1,3, CHEN Chaoshu1,3, YU Fangming1,3
1. School of Environment and Resource , Guangxi Normal University, Guilin 541004, China; 2. College of Life and Environmental Science, Guilin University of Electronic Technology, Guilin 541004, China; 3. Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theoty and Technique, Guilin 541004, China;

Hydroponic culture was conducted to study the effect of Mn and Zn combined single and pollution on the growth, heavy metals of Mn and Zn accumulation and transfer factor(TF), nitrogen metabolism in Mn-hyperaccumulator Polygonum hydropiper L.. The enzymatic activies of nitrogen metabolism including nitrate reductase (NR), glutamine synthetase (GS), glutamineate synthase (GOGAT) glutamate dehydrogenase (GDH) as well as the concentrations of chlorophyll a, b a+b, a/b, NO3-, NH4+, free proline and soluble protein in Polygonum hydropiper L. was determined. Resalts showed that Mn and Zn concentrations of roots, stems and leaves of the Polygonum hydropiper L. , with the increase Mn and Zn control concentration increased, Polygonum hydropiper L. vary 1.0 from 11.9 of Mn and vary 1.0 from 1.8 of Zn of transfer factor. It indicated that Zn had affect on transfer of Mn. Mn/Zn treatment singinficantly reduced contents of chlorophyll a, b and a+b（P<0.05）, but the chlorophyll a/b significantly increased than the control group (P<0.05). Mn/Zn treatment restrained growth of roots and biomass, when T8, root is only 64.93% and T9, biomass is only 65.45% of that in the control group. What single Zn and Mn/Zn combined pollution reduced the contents of NO3-and NR activities, when T5, NR activity in leaves and roots, respectively is 44.36% and 34.41% in the control group; but increased the contents of NH4+, T9, leaf of NH4+content is 2.35 times that of the control group and T8 root of NH4+content is 1.58 times that of the control group; GS activities significantly increased than the control group (P<0.05) of roots and leaves, GS activities are 1.32 and 1.57 times that of the control group of leaf and ront when T9; had no singinficantly efected on soluble protein of roots and leaves of Polygonum hydropiper L.. It indicated that play an important role in the process of elimination NH4+stress.

combined pollution of manganese and zinc; Polygonum hydropiper L.; nitrogen metabolism

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.03.023

X171.5

A

1674-5906（2015）03-517-05

刘华，刘可慧，周振明，苏银萍，陈孟林，陈朝述，于方明. Mn、Zn单一及复合污染对水蓼氮素代谢的影响[J].生态环境学报, 2015, 24(3): 517-521.

LIU Hua, LIU Kehui, ZHOU Zhenming, SU Yinping, CHEN Menglin, CHEN Chaoshu, YU Fangming. Effects of Mn/Zn Single and Combined Pollution on the Nitrogen Metabolism in Polygonum Hydropiper L. [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(3): 517-521.

国家自然科学基金项目（41161057）；广西科学研究与技术开发项目重大专项计划（桂科重 1298002-6）；广西教育厅项目（2013HZ003）；广西自然科学基金项目（2014GXNSFAA118303）；广西科学研究与技术开发项目（桂科转14122008-2）

刘华（1987年生），男，硕士，主要从事环境生态与生物修复研究。E-mail：liuh34@126.com *通信作者：于方明（1975年生），男，教授，博士，主要从事环境毒理学与土壤污染生物修复的研究。E-mail: Fmyu1215@163.com

2013-09-05