健康香蕉(Musa paradisiaca)植株与枯萎病患病植株根区土壤细菌多样性的比较研究

邓晓，李勤奋，武春媛，李怡，刘景坤

1. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；2. 农业部儋州农业环境科学观测实验站，海南 儋州 571737

健康香蕉(Musa paradisiaca)植株与枯萎病患病植株根区土壤细菌多样性的比较研究

邓晓1,2，李勤奋1,2，武春媛1,2，李怡1,2，刘景坤1,2

1. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；2. 农业部儋州农业环境科学观测实验站，海南 儋州 571737

香蕉枯萎病（Fusarium oysporum f. cubense）是当前严重威胁香蕉产业的重要土传病害，目前尚未找到有效的防治措施。本研究利用3个典型香蕉枯萎病患病样地的健康植株根区土壤（WB土）和患病植株根区土壤（FB土）分别直接提取土壤总DNA构建16S rRNA基因克隆文库，分析土壤细菌遗传基因多样性。旨在阐明香蕉枯萎病发病对植株根区土壤细菌多样性的影响，从微生物生态学的角度解释香蕉枯萎病的发生原因并为其防控提供理论依据。结果如下，（1）患病植株根区土壤细菌的基因型数（OTUs）比健康植株减少了18个，香农指数（H'）比健康植株降低了0.66，物种多样性指数（Schao1）比健康植株减少了26。（2）WB文库63个OTUs分属于9个细菌类群和4个尚未确定分类地位基因型，FB文库45个OTUs分属于 8个细菌类群和 2个尚未确定分类地位的基因型。其中厚壁菌（Firmicutes）、变形菌（Proteobacteria）、放线菌（Actinobacteria）、酸杆菌（Acidobacteria）、芽单胞菌（Gemmatimonadetes）和浮霉菌（Planctomycetes）6个门为健康和患病香蕉植株根区土壤中共有的细菌类群。此外，蓝细菌和Bacteria intertae sedis仅存在于WB土中，而硝化螺旋菌仅存在于FB土中。（3）香蕉枯萎病发病对厚壁菌数量分布的影响极大，FB土比WB土总体增加了11%。其中对芽孢杆菌（Bacillus）数量分布的影响极大，FB土中芽孢杆菌数量比WB土增加了15%。上述结果表明，香蕉植株根区土壤细菌遗传基因多样性降低及其群落结构改变是香蕉枯萎病患病的重要特征，其中芽孢杆菌（Bacillus）数量增加是香蕉枯萎病患病的最主要特征。关键词：香蕉枯萎病；土壤；细菌多样性；16S rRNA基因；克隆文库

香蕉枯萎病是由古巴尖镰孢（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）侵染引起维管束坏死的一种毁灭性真菌病害，是世界农业史上记载的分布最广、毁灭性最强的植物病害之一（Molina，2001）。近年来有加重趋势，发病率一般为 10%～40%，严重时超过90%，导致香蕉收获面积锐减，产量与品质下降，香蕉产业面临萎缩。虽然该病已受到全世界的关注，但到目前为止，尚未找到十分有效的防治方法。许多研究发现土传病害的发生与土壤微生物多样性存在一定的相关性。病原菌在微生物多样性高的土壤中很难生存（Rimé等，2003；Benizri等，2005；Perez-Piqueres等，2006）。土传病害的发生也会降低土壤微生物多样性。有研究发现受Phytophthora cinnamani侵染后的鳄梨根系土壤细菌多样性指数呈现降低趋势（Yang等，2001）。也有研究发现患有马铃薯青枯病（Ralstonia solanacearum biovar 2）的土壤比健康土壤的细菌多样性明显减少，且细菌群落结构发生了变化（SchÖnfeld等，2003；Gorissen等，2004）。抑制土传病害需要依赖土壤微生物群体作用，土壤微生物群落结构越丰富、物种越均匀、多样性越高时抑制病原菌能力越强。因此，客观分析土壤微生物多样性变化以及微生物群落结构特征是研究土传病害的关键问题。目前有关香蕉枯萎病患病植株根区土壤微生物多样性的研究报道较少，土壤微生物中又以细菌的种类和数量最多，细菌多样性是土壤生态系统的基本特征之一，也是指示环境质量的有效指标之一，有必要加强此方面的研究。因此，本研究采用16S rRNA基因克隆文库技术对香蕉枯萎病患病植株和健康植株根区土壤中的细菌多样性进行比较研究，旨在阐明香蕉枯萎病患病对根区土壤细菌多样性的影响，从微生物生态学的角度来解释香蕉枯萎病的发生原因及提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土样

土壤样品于2010年4─5月采自海南的十月田（N18.57°，E108.88°）、冲坡（N19.88°，E109.64°）和尖峰（N18.78°，E108.88°）3个种植规模较大（面积大约150亩）且枯萎病患病典型的香蕉种植园。土壤样品分别命名为WB土和FB土。WB土为3个患病样地中健康植株根际与非根际土壤的混合土样；FB土为3个患病样地中患病植株根际与非根际土壤的混合土样。每个样地的健康植株和患病植株均选取代表性植株4株，先分别采集根际与非根际土壤，然后再混合成一个样。装于封口无菌袋中，置于便携式冰盒中带回实验室。根际土壤采用抖根法（Griffiths等，2003），即从田间20～50 cm土层挖出带完整根系的土块，轻轻抖掉多余土，紧附在根系表面，不易被抖下的土壤视为根际土壤，被抖掉的多余土视为非根际土壤。土样带回实验室后，去掉植物根系和石块，过2 mm筛后将3个样地的WB土和FB土按相同比例分别混合均匀，利用四分法将其分成2份：一份冻存于-20 ℃，冷冻干燥后用于提取土壤 DNA；另一份速冻于-70 ℃备用。

1.2 土壤总DNA的提取

采用FastPrep® SPIN Kit for Soil试剂盒提取土壤样品总DNA，为减少随机性偏差，每个土壤样品进行3个平行的总DNA提取，然后再将所有提取的DNA混合成一个样品。

1.3 克隆文库构建

细菌16S rRNA基因PCR扩增采用细菌通用引物27F和1492R（Martin-Laurent等，2001）。PCR反应体系（25 µL）为：HSTMMixture，12.5 µL；引物0.5 µL+0.5 µL；0.5% BSA，1 µL；基因组DNA，0.5 µL；Milli-Q Water，10 µL。PCR扩增条件为：预变性94 ℃，5 min；变性，94 ℃，1 min；退火，52 ℃，1 min；延伸72 ℃，1.5 min；30个循环后，72 ℃，延伸10 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶检测。利用凝胶回收试剂盒纯化16S rRNA基因片段，然后通过PMD®19-T Simple Vector Systems连接在载体上，转入感受态细胞 Trans10。涂布到含有氨苄青霉素(Amp)/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上，37 ℃下培养12～16 h，白色克隆子即为阳性转化子。4 ℃保存，备进一步 PCR扩增用。利用M13-47和RV-M(M48)进行菌落PCR，筛选插入目的片断的阳性克隆子，构建克隆文库。将每个文库阳性克隆子的菌落 PCR产物分别用核酸限制性内切酶MspⅠ完全酶切。采用PhotoShop软件，分析酶切后的谱型。

1.4 序列分析与序列登记号

从每个文库中分别随机选取 90个具有不同谱型的克隆子进行测序，测序工作由上海生工完成。将测序所得序列在NCBI中进行同源性比对，挑选与序列亲缘关系最相似序列，再利用CHECK-CHIMERA软件分析检查去除嵌合及怪异序列（Maidak等，1999）。将测定的序列在 NCBI上进行比对，利用ClustalW和Mega4.0软件分析多重比对结果，采用邻接法（Neighbor-Joining）建构系统发育树。将16S rDNA序列提交GenBank核苷酸数据库，数据库登录号分别为 WB克隆文库（JX133604-JX133666）和FB克隆文库（JX133559-JX133603）。

1.5 数据处理与分析

通过对所获得的序列进行同源性比较，同源性≥97%的序列视为同一操作分类单位（OTU）。微生物多样性指数的计算分别采用 OTUs，覆盖率指数（C），香农多样性指数（H′）和Chao1物种丰富度指数（Schao1）进行计算：

式中 n1为仅有 1个克隆的操作分类单位数（OTU），N为所分析的克隆总数（Good，1953）；

式中N为所分析的克隆总数，ni为第i个OTU所代表的克隆数（Krebs，1998）；

式中Sobs为文库中的OTU数，F1和F2分别为仅有1个和2个克隆的OTU数（Chao，1987）。

2 结果与分析

2.1 克隆文库构建与ARDRA分析

通过菌落PCR验证，每个文库各挑取192个阳性克隆子构建2个16S rRNA基因克隆文库，2个克隆文库分别命名为FB文库（FB土）和WB文库（WB土），图1为部分菌落PCR验证结果。从每个文库中各挑取144个阳性克隆子进行16S rDNA扩增片段的限制性酶切分析，图2为部分酶切结果。结果表明，FB文库获得98个不同谱型，WB文库获得121个不同谱型。

图1 16S rRNA基因阳性克隆子菌落PCR验证部分结果Fig. 1 Partial results of screening for positive clone of 16S rRNA from different soil samples by colony PCR

图2 MspⅠ酶切部分电泳图Fig. 2 Partial resurlts of MspⅠrestriction patterns

表1 FB和WB 2个文库的多样性指数Table 1 Diversity indices of 2 16S rRNA gene clone libraries of FB and WB

2.2 细菌16S rDNA多样性指数

分别将 FB和 WB两个文库中的 90个ARDRA谱型的阳性克隆子送出测序，共获得 171条长度约为1500 bp的16S rDNA序列。其中FB文库82条，WB文库89条。通过对所获得的序列进行同源性比较和Chimera检查，去除嵌合体，结果显示（表1），FB文库拥有45个OTUs，WB文库拥有63个OTUs。多样性指数分析表明WB和FB两个文库的覆盖率分别为48.3%和62.2%。覆盖率一般用来评估所构建的文库对环境微生物多样性的体现，该结果从理论上讲WB土所分析的克隆还不能反映环境中一半的细菌多样性，而FB土所分析的克隆能反映环境中大于一半的细菌多样性。这从另一个侧面说明WB土的细菌多样性明显高于FB土。此外，由表1还可知，WB和FB两个文库的香农指数（H′）分别为4.1130和3.4528，物种丰富度指数 Schao1分别为 87.4和 61.4。H′和 Schao1主要用来评估文库所代表的环境微生物多样性，H′是反映物种丰富度和物种均匀度的综合性多样性指数，Schao1是通过外推法来预测环境中物种的总个数。因此，可以预测WB土中可能有87个种类的细菌，而FB土中只可能有61个种类的细菌，3个多样性指数的分析结果同时表明WB土的细菌多样性明显高于FB土。

2.3 细菌16S rDNA序列分析

分别对FB和WB两个文库获得的所有OTUs的16S rDNA序列用Ribosomal Database Project 11在线分析后，得到两个文库的细菌分类地位，结果见图3。WB文库63个OTUs分属于9个细菌类群：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放 线 菌 门 （ Actinobacteria）、 酸 杆 菌 门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、蓝 细 菌 门 （ Cyanobacteria）、 浮 霉 菌 门（Planctomycetes）、Bacteria intertae sedis和尚未确定分类地位的细菌类群（4个基因型）；FB文库45个OTUs分属于8个细菌类群：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospia）和尚未确定分类地位的细菌类群（2个基因型）。说明WB土中的细菌类群多于FB土。WB土和FB土的优势类群均为厚壁菌，分别占其整个文库的64%和75%，其次是变形细菌，分别占11%和9%；第三为放线菌，WB土和FB土分别占8%和6%；其余各类群所占比例较少。说明香蕉枯萎病发病对土壤厚壁菌数量分布的影响极大，FB土比WB土增加了11%。此外，蓝细菌和Bacteria intertae sedis仅存在于WB土中，而硝化螺旋菌仅存在于FB土中。

图3 FB和WB 2个文库的细菌类群分布图Fig. 3 Distribution of bacteria population from 2 16S rRNA gene clone libraries of FB and WB

分别对2个文库第一优势类群厚壁菌的OTUs的序列进行系统发育树的构建，结果见图4和图5。图4表明厚壁菌在FB文库中包含的26个基因型（61个克隆）中有16个基因型（35个克隆）属于芽孢杆菌；3个基因型（17个克隆）属于不可培养的种群；属于其他种属的克隆均较少。说明芽孢杆菌为WB土壤中的主要种群，占总克隆的43%。从图5中可以看出，厚壁菌在WB文库中包含的33个基因型（58个克隆）中有14个基因型（25个克隆）属于芽孢杆菌（Bacillus）；4个基因型（4个克隆）属于类芽孢杆菌（Paenibacillus）；属于其他种属的基因型均较少。同样表明芽孢杆菌为FB土中的第一优势种群，占总克隆的28%。上述结果表明FB土对芽孢杆菌数量分布的影响极大，其含量比WB土中增加15%。

3 结论与讨论

3.1 讨论

本研究分别采用覆盖率评估所构建文库对土壤微生物多样性的体现程度，shannon指数评估文库所代表的土壤微生物多样性程度和Chao1物种丰富度指数预测土壤中微生物总的种类数。结果表明，两个文库的覆盖率表现为 FB>WB，而基因型数、仙农指数和 Chao物种丰富度指数均表现为FB

图4 FB文库中厚壁菌系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of the Firmutes clones obtained from 16S rRNA gene clone libraries of FB

3.2 结论

香蕉植株根区土壤细菌遗传基因多样性降低及其群落结构发生改变是香蕉枯萎病患病的重要特征，其中芽孢杆菌（Bacillus）在香蕉植株根区土壤中的比例含量增大是香蕉枯萎病患病的主要特征。

图5 WB文库厚壁菌系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of the Firmutes clones obtained from 16S rRNA gene clone libraries of WB

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Comparison of Soil Bacterial Genetic Diversity in Root Zone of Banana(Musa paradisiaca) Infected with Fusarium Wilt and Non-Infected Plants

DENG Xiao1,2, LI Qinfen1,2, WU Chunyuan1,2, LI Yi1,2, LIU Jingkun1,2
1. Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China; 2. Danzhou Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment, Ministry of Agriculture, Danzhou 571737, China

Currently banana fusarium wilt (Fusarium oysporum f. cubense) is one of the important soil-borne diseases of seriously threat to banana production. However, there is no effective method for prevention in the world. The objective of this study was providing research information for the prevention of banana fusarium wilt from the perspective of microbial ecology. Two gene libraries of 16S rRNA were constructed by directly extracted from soil total DNA. And the soil samples were collected from root zone of banana which infected with fusarium wilt and non-infected plants in three typical plots infected by banana fusarium wilt (Jianfeng, Shiyuetian, Chongpo) in Hainan Province. The soil bacterial genetic diversity was analyzed by DNA sequencing and phylogenetic characters. The results were shown as follows: (1) the number of operational taxonomic units (OTUs) in soils from root zone of banana which infected with fusarium wilt was 18 lower than that of non-infected plants. The Shannon index (H') and calculated species richness (Schao1) in soils from root zone of banana which infected with fusarium wilt was respectively 0.66 and 26 lower than that of non-infected plants. (2) 63 OTUs were belonged to 9 bacterial taxa and 4 non-determined genotypes in soils from non-infected plants, and 45 OTUs were belonged to 8 bacterial taxa and 2 non-determined genotypes in soils from fusarium wilt infected plants. And the 6 bacterial phyla of Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria, Gemmatimonadetes and Planctomycetes among them were common bacterial taxa in soils from root zone of banana both infected with fusarium wilt and non-infected plants. However, Cyanobacteria and Bacteria intertae sedis were only existed in the soils from root zone of banana plants which non-infected with fusarium wilt. In contrast, Nitrospia was only observed in the soils from root zone of infected plants. (3) The proportion of Firmicutes in soils from fusarium wilt infected plants was 11% higher than that of non-infected plants. Meanwhile, the increasing of Bacillus proportions in soils from fusarium wilt infected plants was also 15% higher than that of non-infected plants. These results indicated that the reducing of soil bacterial genetic diversity and its changing of community structure was important characteristics on occurrence of banana fusarium wilt, and increasing in the number of Bacillus in soil was the most important characteristics on occurrence of banana fusarium wilt.

banana fusarium wilt; soil; bacterial diversity; 16S rRNA gene; clone library

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.03.006

Q938.1

A

1674-5906（2015）03-0402-07

邓晓，李勤奋，武春媛，李怡，刘景坤. 健康香蕉(Musa paradisiaca)植株与枯萎病患病植株根区土壤细菌多样性的比较研究[J]. 生态环境学报, 2015, 24(3): 402-408.

DENG Xiao, LI Qinfen, WU Chunyuan, LI Yi, LIU Jingkun. Comparison of Soil Bacterial Genetic Diversity in Root Zone of Banana (Musa paradisiaca) Infected with Fusarium Wilt and Non-Infected Plants [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(3): 402-408.

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2008hzs1j015；2009hzs1j022）

邓晓（1976年生），女，助理研究员，博士。研究方向为环境微生物生态。E-mail:dx0928@foxmail.com

2014-12-10