不同心功能糖尿病心肌病大鼠瞬时外向钾电流的变化及意义

刘星，张良胜，杨锦龙，陈俞瑾，诸波，査克岚，杨悠，范忠才

（1泸州医学院附属医院，四川 泸州 646000;2永城市人民医院）

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病常见的心血管并发症，其发病率高，常伴发多种心律失常，是导致患者心力衰竭和死亡的主要原因［1，2］。心律失常的发生除与基础疾病造成的心脏结构改变（即结构重构）外，还和电流通道改变（即电重构）有密切关系。就单个心肌细胞而言，瞬时外向钾电流（Ito）是参与细胞1期复极及平台期形成的主要离子流，对动作电位不应期的形成及维持其稳定性起着重要作用。当Ito发生改变时，必将导致心肌细胞动作电位变化，从而可能引起心律失常。2012年12月～2013年11月，本研究通过比较不同心功能DCM大鼠心肌细胞Ito的变化，进而探讨在不同病理状态下其离子通道变化情况以及心律失常可能的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:清洁级SD成年大鼠30只，均为雄性，体质量180～220 g，购于第三军医大学医学实验动物中心。主要试剂:复合麻醉剂、胶原酶Ⅱ、乙二醇双四乙酸、羟乙基哌嗪乙磺酸、链脲佐菌素（STZ），均为Sigma公司产品。主要仪器:动物呼吸机（江西特力呼吸机设备公司），GE Vivid7.0心脏超声心动仪（美国GE），膜片钳放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan），A/D转换器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA），三维操纵器（WN 203，Narishige，Japan），电极经横式拉制机（P-97 sutter，USA），Langendorff灌流装置（ML176，Austrilia）等。

1.2 动物分组及DCM、DCM心衰模型的建立 30只大鼠随机分成3组:对照组（n=10）、DCM组（n=10）、DCM心衰组（n=10）。对照组始终以普通饲料喂养，DCM组及DCM心衰组均以高脂饮食喂养。DCM组:10只SD大鼠，喂养至第6周以1%STZ 30 mg/kg腹腔注射，对照组以同体积柠檬酸缓冲液一次性腹腔注射。72 h后尾静脉取血测血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L判断为2型糖尿病造模成功。造模成功后继续高脂高糖饲料喂养6周。DCM心衰组:10只SD大鼠按照上述方法制作成DCM大鼠，于注射STZ后第3周进行左冠状动脉结扎术:用复合麻醉剂进行腹腔注射麻醉，气管插管，设定呼吸机参数（呼吸频率90次/min，呼吸比1∶1，潮气量10～12 mL）。胸骨左侧3～4肋间开胸，暴露心脏，在左心耳和肺动脉圆锥之间用5-0丝线结扎左冠状动脉前降支，观察左室前壁心肌颜色变苍白，搏动减弱时关闭胸腔。大鼠自主呼吸恢复后拔除气管插管。术后伤口定期换药，继续高脂高糖饲料喂养至术后第3周。同时选择对照组大鼠进行假手术，实验步骤与前相同但不结扎左冠状动脉。

1.3 心功能的测定 DCM组和DCM心衰组分别于结扎术后第3周，采用GE Vivid7.0心脏超声心动仪12S探头，经大鼠胸骨左心长轴乳头肌切面分别测量:左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD），每次测量3个心动周期后取平均值。并根据Teichholtz矫正公式计算出左室射血分数（LVEF）、左室内径缩短率（LVFS）。

1.4 病理学变化的观察 随机抽取对照组、DCM组及DCM心衰组各3只大鼠左心室进行连续切片，然后HE染色、显微镜下观察并拍照记录病理变化。

1.5 心肌细胞的分离 将无钙台液、KB液和酶液分别用95%O2和5%CO2饱和30 min，打开与Langendorff相连的恒温浴槽。用去离子水冲洗Langendorff系统10 min。将3%戊巴比妥钠0.2 mL/100 g、肝素4 U/g注入SD大鼠腹腔。麻醉成功后，剪开大鼠胸腔，迅速取出心脏后置于4℃无钙台液中，经主动脉逆行插管，固定于Langendorff灌流装置上。先用无钙台液冲净残存在冠状动脉和心室中的血液，换成消化酶液，以8 mL/min持续灌流6～7 min，然后每隔1 min剪取一小块左心室组织，共10次，依次装于盛有KB液的10个小瓶中。将取下的心肌组织块剪碎，用吸管轻轻吹打，再用200目筛网过滤，得到细胞混悬液，置于氧饱和的KB液保存，室温下1 h后置于4℃冰箱中备用。

1.6 Ito电流密度的测定 取急性酶分离的大鼠心肌细胞，采用全细胞膜片钳记录模式记录电流。选择细胞膜光滑完整、横纹清楚、无收缩的细胞，制作形成细胞贴附式膜片，在此基础上，向微电极内给予较强的负压形成全细胞记录构型。最后施以Ito刺激方案，保持电位于-80 mV下，以10 mV为阶跃，自-50 mV去极化至+70 mV，钳制时间为300 ms引导出Ito刺激波形。使用膜片钳放大器记录电流信号，经 A/D转换器处理后，用 Clampex（version 10.1）软件系统采集后储存于计算机中。采样频率为10 kHz，采样方式为Clampex下的Episodic stimulation［3］。电流密度 = 电流强度（I）/膜电容（c）。

1.7 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件。结果以±s表示，3组比较采用单因素方差分析、组间比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心功能指标比较 见表1。

2.2 各组心肌病理切片观察结果 对照组心肌纤维排列整齐，可见横纹，胞质丰富，细胞间隙正常。DCM组及DCM心衰组心肌细胞排列紊乱、扭曲、部分断裂，纤维化明显，符合DCM心肌病理变化，其中尤以DCM心衰组大鼠表现显著。

表1 各组 LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS 比较（±s）

表1 各组 LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS 比较（±s）

注:与对照组比较，﹟ P ＜0.05;与 DCM组比较，▲P ＜0.05。

组别 n LVEDD（mm） LVESD（mm） LVEF（%） LVFS（%）对照组 10 5.72±0.45 4.07±0.35 61.62 ±4.34 32.12±3.82 DCM 组 10 5.76±0.48 4.09±0.47 61.37 ±5.85 31.85±4.13 DCM 心衰组 10 7.82±0.46﹟▲ 6.74±0.52﹟▲ 44.86±4.25﹟▲ 19.29±3.98﹟▲F 67.86 114.99 38.88 33.93 P 0.00 0.00 0.00 0.00

2.3 各组左心室心肌细胞Ito变化 施以Ito电流刺激方案后，引导出各实验组Ito电流图（图1）。各组Ito的电流密度比较见表2。各组I-V曲线见图2。3组的I-V曲线均呈线性依赖性，为内向整流特性，从指令电压-50 mV至-20 mV，电流幅度增加不明显，3组曲线走向均平缓。从指令电压-20 mV至+70 mV，对照组电流增幅较大，而 DCM组及DCM心衰组增幅较小，两者均较对照组明显下移，尤其是在指令电压+10 mV以后更为明显，且以DCM心衰组下移显著。见图2。

图1 各组Ito电流图及Ito刺激方案

图2 各组I-V曲线图

3 讨论

DCM是以心肌代谢紊乱为特征的特异性心肌疾病，其发病率高，是糖尿病的主要心血管并发症［1，2］。DCM 早期主要表现为舒张功能降低，晚期以收缩功能障碍为主，而随着心功能的变化其心律失常概率也明显增加，是导致患者死亡的主要原因［4，5］。一方面，心功能下降使心脏极易发生各种心律失常［6］。另一方面，糖尿病本身是多种心律失常的致病因子或高危因素，如房颤、室性心律失常等［7，8］。但DCM发病的具体机制目前并不完全清楚。心律失常的发生与心脏的结构重构和电重构有密切关系。因此，推测DCM心律失常的发生除与其代谢紊乱造成的心肌结构变化外，可能还与离子流及其通道的改变有关。单个心肌细胞存在多种离子通道，其正常分布和离子流规则活动是维持心肌细胞正常电活动的基础。其中，K+直接参与心肌电兴奋的恢复过程，对心肌动作电位时程（APD）的长短具有决定性作用，故K+浓度及K+通道的变化是导致严重心律失常的重要因素。Ito是主要的外向性K+流，在心肌动作电位0相时被激活，参与了动作电位1相复极过程，并对动作电位2相的起始水平起决定性作用;调节L-Ca2+通道及Na+-Ca2+交换的活性，从而对APD有明显影响［9］。有研究认为，单纯Ito减小使动作电位平台起点较高（位于正电压水平），导致Ca2+内流电-化学驱动力下降，Ca2+内流减小、复极加快进而使APD缩短，可引发各种心律失常［10］。因此，研究Ito在电重构中的作用有重要意义。

表2 各组Ito的电流密度比较（n=10，pA/pF，±s）

表2 各组Ito的电流密度比较（n=10，pA/pF，±s）

注:与对照组比较，*P ＜0.05。

测试电压（mV） 对照组 DCM组 DCM心衰组-50 0.05 ±0.02 0.13 ±0.01 0.14 ±0.12-40 0.06 ±0.04 0.17 ±0.31 0.20 ±0.03-30 0.49 ±0.40 0.86 ±0.82 1.02 ±1.02-20 1.91 ±0.83 1.98 ±0.14 2.07 ±2.33-10 4.35 ±2.01 3.61 ±2.45 3.39 ±3.35 0 6.92 ±2.80 4.62 ±4.05 4.09 ±4.05+10 8.90 ±3.20 6.10 ±5.31 5.28 ±5.06+20 12.50 ±4.00 7.21 ±5.30 6.49 ±6.02+30 17.07 ±4.52 10.12 ±6.30 7.92 ±7.03+40 24.15 ±4.72 11.40 ±6.85 9.05 ±7.35+50 27.90 ±5.02 13.74 ±7.12 10.83 ±8.01+60 32.11 ±4.52 15.31 ±8.71 12.05 ±9.02*+70 38.65 ±5.05 17.70 ±9.21* 15.22 ±9.13*

本研究主要证实了DCM大鼠心室肌细胞存在Ito电流密度的变化，并且随着心功能的下降其变化更加明显。首先，对比DCM组和对照组:当电压为+70 mV时，DCM组的Ito电流密度较对照组明显降低，I-V曲线也较对照组下移明显。结合分析大鼠周龄及心脏功能变化，说明在出现收缩功能障碍前即DCM大鼠仅有舒张功能下降时就出现了Ito的减弱，这可能是DCM发生心律失常的早期离子基础。其次，对比DCM心衰组和对照组:当电压为+60 mV时，DCM心衰组的电流密度就比对照组明显降低，这比DCM组出现要早，从I-V曲线看，DCM心衰组较对照组下移更加明显。结合心功能变化，说明当DCM大鼠出现收缩功能障碍时，Ito的变化更加显著，这可能是DCM晚期极易发生心律失常的原因之一。虽然DCM组和DCM心衰组在Ito电流密度的变化上没有统计学意义，但通过分析I-V曲线变化的趋势以及与对照组对比其变化的时间早晚，我们认为DCM心衰组有变化更为显著的趋势，这说明随着DCM心功能的改变其Ito亦随之变化，推测改善心功能可有助于稳定其Ito。

总之，DCM除因代谢紊乱造成的心肌结构的改变，其还存在电活动的改变，尤其当心功能下降时这种改变更加显著，这些变化共同组成了DCM心律失常的基础，其中Ito扮演着重要角色。对DCM电重构的深入研究将有助于阐明其心律失常的机制，并有助于寻找特异性的治疗方案。

［1］Boudina S，Abel ED.Diabetic cardiomyopathy revisited［J］.Circulation，2007，115（25）:3213-3223.

［2］Cai L，Kang YJ.Oxidative stress and diabetic cardiomyopathy:a brief review［J］.Cardiovasc Toxicol，2001，1（3）:181-193.

［3］刘振伟.实用膜片钳技术［M］.北京:军事科技出版社，2006:90-103.

［4］van Melle JP，Bot M，de Jonge P，et al.Diabetes，glycemic control，and new-onset heart failure in patients with stable coronary artery disease:data from the heart and soul study［J］.Diabetes Care，2010，33（9）:2084-2089.

［5］Fagher K，Löndahl M.The impact of metabolic control and QTc prolongation on all-cause mortality in patients with type 2 diabetes and foot ulcers［J］.Diabetologia，2013，56（5）:1140-1147.

［6］Cai C，Hua W，Ding LG，et al.High sensitivity C-reactive protein and cardfiac resynchronization therapy in patients with advanced heart failure［J］.J Geriatr Cardiol，2014，11（4）:296-302.

［7］Nichols GA，Reinier K，Chugh SS.Idependent contribution of diabetes to increased prevalence and incidence of atrial fibrillation［J］.Diabetes Care，2009，32（10）:1851-1856.

［8］Huxley RR，Alonso A，Lopez FL，et al.Type 2 diabetes，glucose homeostasis and incident atrial fibrillation:the Atherosclerosis Risk in Communities Study［J］.Heart，2012，98（2）:133-138.

［9］Grant AO.Cardiac ion channels［J］.Circ Arrhythm Electrophysiol，2009，2（2）:185-194.

［10］Tomita F，Bassett AL，Myerburg RJ，et al.Diminished transient outward currents in rat hypertrophied ventricular myocytes［J］.Circ Res，1994，75（2）:296-303.