尖锐湿疣患者的细胞免疫功能及其与阴茎包皮组织中HPV DNA水平的相关分析

王一鸣，程燕，树瑜

(成都市第二人民医院，成都610017)

尖锐湿疣(CA)系人乳头瘤病毒(HPV)感染所致的一种常见和易复发的性传播疾病，其发生、复发及转归可能与HPV载量及机体的免疫状况有关。细胞免疫功能异常可能是造成病毒持续感染的主要原因之一，尤其是T淋巴细胞数量和功能的异常。本文对CA患者病毒载量及外周血T淋巴细胞亚群(CD+3、CD+4、CD+8)进行检测，并对细胞免疫与病毒载量之间相互关系进行了分析，旨在为CA发病机制及其治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1～12月本院皮肤性病科门诊就诊的CA患者81例(CA组)，均符合卫生部疾病控制司制定的CA诊断标准。男49例、女32例，年龄20～70岁。初发患者41例，复发患者40例。30例正常对照来自本院包皮环切术的健康男性(对照组)，近期无局部感染和CA史。排除免疫功能低下或长期服用免疫抑制剂、糖尿病、不能定期随访者。

1.2 CA患者外周血CD+3、CD+4、CD+8T细胞百分比的检测 治疗前后1个月取外周血2 mL，加入到EDTA抗凝管中，混匀。取流式细胞仪上样管，每管中加入外周血100 μL(经EDTA抗凝处理)混匀，然后分别加入 20 μL CD3-FITC、CD4-FITC/CD8-PE 抗体，充分混匀，室温避光孵育30 min，隔10 min手工轻摇1次，以便荧光标记抗体与样品充分反应，然后加入红细胞裂解液500 μL充分混匀，避光孵育10 min，PBS 洗细胞 1 次(2 000 r/min，5 min)，弃去上清液，每管加500 μL鞘液，充分混匀，上机检测。

1.3 CA组织中HPV6/11 DNA水平的检测 采用PCR法。暴露疣体，常规消毒，用血管钳摘取部分疣体组织，部分标本置入备有1 mL生理盐水的无菌样本管中，标本存于-20℃冰箱待检。部分标本经10%中性甲醛室温固定、石蜡包埋、室温存放、实验时将标本制成4 μm厚的石蜡切片。DNA提取:取出待测样本(组织需剪碎)，置于室温下解冻，振荡混匀后取100 μL于另一无菌的0.5 mL离心管内，13 000 r/min离心10 min，小心吸弃上清液，保留沉淀物，再向沉淀物内加入DNA提取液50 μL，振荡混匀，100℃沸水浴10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清液待用。DNA抽提和PCR扩增:HPV阳性标准品的稀释和标本处理按试剂盒说明书操作。取PCR反应管1支，加入处理后的标本或阳性标准品2 μL，8 000 r/min离心数秒，将各反应管放入PCR仪的反应槽内，按对应顺序设置阴性对照、阳性标准品梯度及未知标本采用热启动法扩增。扩增条件:93℃预变性2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，10个循环;93℃ 30 s，55℃ 45 s，30个循环。计算机分析，确定基线和阈值，建立标准曲线，读取并计算各管DNA含量。

1.4 治疗方法 对所有CA患者的疣体均采用CO2激光去除，待伤口愈合后外用干扰素凝胶，每周复查1次，术后随访3个月。肉眼疣体消失，无新发疣体出现为治愈，在原皮损处或邻近部位有新疣体出现者为复发。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，比较采用成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HPV6/11 DNA比较 在81例CA中，检出HPV6/11型阳性者77例(95.06%)。CA初发及复发者阴茎包皮组织中HPV6/11 DNA分别为(2.31×103～3.72 ×104)copies/mL 和(4.63 ×104～1.7×106)copies/mL，复发组高于初发组(t=-28.541，P ＜0.01)。HPV6/11 型高载量组(复发患者)30例(38.96%)，低载量组(初发患者)47例(61.04%)。

2.2 两组外周血T细胞亚群比较 见表1。

表1 两组外周血T细胞亚群比较(±s)

表1 两组外周血T细胞亚群比较(±s)

组别 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+4/CD+8 CA 组 81 62.83 ±9.11 31.74 ±8.53 30.67 ±8.39 1.19 ±0.73对照组 30 71.54 ±8.42 42.39 ±8.38 25.26 ±8.32 1.69 ±0.79 t 4.86 5.32 6.04 3.25 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 高载量与低载量组CA患者外周血T细胞亚群比较 见表2。

表2 高载量与低载量组CA患者外周血T细胞亚群比较( ± s)

表2 高载量与低载量组CA患者外周血T细胞亚群比较( ± s)

组别 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+4/CD+8高载量组 30 62.32 ±8.52 29.73 ±6.87 32.76 ±8.46 0.89 ±0.65低载量组 47 62.89 ±9.12 32.97 ±5.64 29.84 ±7.31 1.13 ±0.72 t 1.32 4.87 4.39 3.96 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

HPV是一种DNA病毒，属乳多空病毒科，是最小的DNA病毒，也是一种致瘤病毒，皮肤和黏膜上皮细胞是它的宿主细胞，具有感染及嗜鳞状上皮的特性。病毒感染各种鳞状上皮细胞后，具有促上皮增长、促瘤形成的特性［1］，可引起上皮肿瘤或疣，是CA最重要的致病原因。HPV有100多种亚型，其中侵犯泌尿生殖系统的有20个型以上。CA与HPV6、11、16、18、31、33 型感染有关，其中 90%以上为HPV6/11亚型感染，少数为 HPV16/18亚型［2］。根据它们在生殖系统肿瘤形成中所发挥的不同作用，将HPV分为高危组(HPV16/18型等)和低危组(HPV6/11型)，高危组的病毒DNA通常整合到宿主基因中，其作用可能为启动癌基因［3］。而低危组的HPV病毒常诱发良性湿疣或宫颈损伤，通常不整合到宿主基因中。CA是由HPV感染引起的，但与CA患者接触后是否发病以及是否复发，在很大程度上取决于接触者感染的病毒量及特异性免疫力，高载量的HPV对局部细胞免疫抑制作用相对加强，使机体难以有效清除病毒。Che等［4］研究认为，复发性CA的HPV DNA明显高于初发性CA，HPV DNA的载量随着复发次数以及病程的增加而升高，二者呈正相关，故认为病毒载量在CA的发病及复发中起着一定作用。De Marco等［5］研究了40例肛门生殖器CA患者，结果也表明HPV载量高的CA患者病程明显长于载量低者。但也有学者发现HPV DNA含量与其复发无明显关系［6］。本研究81例标本中，HPV6/11型阳性检出率95.06%，与国内外报道接近。复发组与初发组相比，两组DNA载量差异有统计学意义，说明病毒载量在CA的复发中起着一定的作用。

T细胞是细胞免疫的主要效应细胞，T细胞参与的细胞免疫应答是机体控制感染的关键［7］，它与NK细胞、巨噬细胞等一起构成了抗病毒免疫的主体，其表面的CD分子是T细胞发挥生物学功能的分子基础，CA的发生、消退、复发及癌变与机体的免疫功能密切相关，Th1/Th2细胞因子优势的互换，对CA的转归起着决定性作用。HPV感染后，机体存在特异性细胞免疫受抑制现象，不能建立有效的免疫反应，是HPV持续感染的主要原因。Morelli等发现，感染HPV的生殖器皮损处主要有CD4+和CD8+T细胞浸润，且CD4+/CD8+下降，而在消退的皮损中，T细胞数量增加，主要为CD4+T细胞，CD4+/CD8+高于未消退的皮损，表明疣体消退时宿主细胞免疫功能恢复或增强。Kawana等也在HPV6 DNA阳性的妊娠期CA患者母体、脐血和婴儿血清中均检测到了抗HPV6抗体，故认为局部HPV感染导致局部的细胞免疫状态改变，全身血液中感染有HPV，同样也能引起全身细胞免疫状态的改变。本研究通过检测CA患者与正常人的外周血T淋巴细胞亚群，发现CA患者与正常人相比，外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4+T细胞/CD8+T细胞均低，而CD8+T细胞升高，与文献报道结果基本一致，提示CA患者细胞免疫功能受到抑制。

CA复发率较高，常难彻底治愈。研究发现，CA复发与T淋巴细胞、NK细胞免疫抑制相关联，与病毒载量也有相关性。本研究发现，高载量组患者CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+较低载量组均降低，而CD8+T细胞升高，表明高载量组细胞免疫功能低于低载量组，进一步说明CA复发与患者T淋巴细胞亚群比例有关。

总之，CA患者复发者的病毒载量高于初发者，细胞免疫功能较正常人下降，且病毒载量高的CA患者细胞免疫功能低于病毒载量低者，为CA术后加用免疫调节剂治疗、预防CA复发提供了理论依据。

［1］Fennerty MB.Helicobacter pylori:why it still matters in 2005［J］.Cleve Clin J Med，2005，72(Suppl 2):S1-S7.

［2］Stanley M.HPV vaccines:are they the answer［J］.Br Med Bull，2008，88(1):59-74.

［3］ Stanley M.The epidemiology and burden of HPV disease［J］.Nurs Times，2008，104(36):38-40.

［4］Che YM，Wang JB，Liu YH.Correlation between deoxyribonucleic acid loads of human papillomavirus and recurrence of condylomata acuminata［J］.Int J STD AIDS，2005，16(9):605-607.

［5］De Marco F，Di CA，Poggiali F，et al.Detection of HPV in genital condylomata:correlation between viral load and clinical outcome［J］.J Exp Clin Cancer Res，2001，20(3):377-383.

［6］吴文中，刘姝莉，李延武，等.尖锐湿疣患者荧光定量PCR检测结果分析［J］.中国艾滋病性病，2006，12(4):350-351，360.

［7］Kim KH，Greenfield W，Shotts E，et al.Detection of human papillomavirus type 16-specific T lymphocytes by a recombinant vaccinia virus-based enzyme-linked immunospot assay［J］.Clin Vaccine Immunol，2007，14(4):362-368.