东北菱粗多糖的提取和纯化方法的评价

刘 阳，张 岩，谢文兵，伍翔群，郭 建，迪拉热·力迪甫，牛凤兰

（1.吉林大学公共卫生学院卫生检验学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院耳鼻咽喉－头颈外科，吉林 长春 130021；3.中国科学院长春应用化学研究所 国家电化学和光谱研究分析中心，吉林 长春 130021）

东北菱性味甘凉，清暑解热，益气健脾［1］，富含蛋白质、维生素、氨基酸和多糖等多种活性成分［2］，具有广泛的食用价值和药用价值［3］。比较国外同类研究，东北菱提取物有更强的抑制肝癌细胞和肺癌细胞生长的作用及更强的抗氧化能力［4－7］。菱角粗多糖具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用及较强的清除自由基的能力［8－9］。这类药食同用植物多糖无细胞毒性，已成为当前研究的热点。本实验用甲醇、乙醇和丙酮3种溶剂对东北菱进行提取，探讨最佳提取溶剂。在多糖提取液中，蛋白质占的比例很大，如何去除粗多糖中的蛋白质，一直是多糖分离纯化的一个难题。本实验采用Sevag法、三氯乙酸法、盐酸法和活性炭法4种传统方法［10］对菱角粗多糖进行纯化，对纯化效果进行比较，为菱角粗多糖活性的深入研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

本研究所用东北菱采集于吉林省大安县，经吉林农业大学樊绍钵教授鉴定是水生草本植物菱的果实。东北菱粗提物由本实验室制备；苯酚 （吉林亚泰生物药业有限公司，配置成5%苯酚溶液），活性炭 （天津永大化学试剂开发中心），氯仿、正丁醇、三氯乙酸、盐酸、标准葡萄糖、浓硫酸、磷酸、甲醇、乙醇和丙酮 （均为分析纯，北京化工厂），标准牛血清蛋白 （北京鼎同生物技术责任有限公司），考马斯亮蓝G－250（中国医药集团上海化学试剂公司）。PE Lambda 900紫外可见分光光度计 （美国PE公司），电子天平 （赛多利斯科学仪器有限公司），HH－1数显恒温水浴锅 （金坛市江南仪器厂），DZF－6050真空干燥箱 （上海一恒科技有限公司），TDL－40B离心机 （上海安亭科学仪器厂），超声波清洗机 （宁波新芝生物科技股份有限公司），旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 东北菱粗多糖的提取

1.2.1 东北菱甲醇、乙醇和丙酮提取物的制备精确称取东北菱粗提物20.00g置于500mL锥形瓶中，分别用70%甲醇、乙醇和丙酮200mL为提取溶剂进行提取，40℃加热回流提取4h，提取液过滤，旋转蒸发，冷冻干燥，低温低压条件下将所得滤液置于100mL容量瓶中，定容至刻度，即得东北菱的甲醇、乙醇和丙酮提取物，4℃冰箱保存待用。

1.2.2 苯酚－硫酸法测定多糖水平 精密称取100mg干燥至恒重的葡萄糖对照品置于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，备用。使用时稀释10倍，即得质量浓度为100mg·L－1标准葡萄糖对照溶液。精确吸取标准葡萄糖溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL置于10mL具塞试管中，加蒸馏水补充至2.00mL，依次加入5% 苯酚溶液1.60mL，浓硫酸5mL，混合均匀，恒温水浴箱中沸水浴30min，冷却后，在波长490nm处测溶液吸光度 （A）值，以标准葡萄糖溶液质量浓度为横坐标，A值为纵坐标，建立标准曲线。见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

标准曲线符合线性关系，将测得的各样品A值代入回归方程Y＝0.0049X－0.0512，即可得样品中多糖水平。

样品中多糖水平的测定：精密称取各东北菱提取物100mg置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，用时稀释10倍，得到质量浓度为100mg·L－1的提取物溶液，备用。精确吸取各提取物溶液2mL，依次加入5% 苯酚溶液1.60mL，浓硫酸5mL。摇匀，沸水浴30min，冷却后测溶液的A490值，计算多糖水平。多糖水平＝A490值对应多糖的水平／样品的质量×100%。

1.2.3 加样回收法测样本回收率 精密称取已知多糖水平的提取物样品溶液，吸取5份，每份1.48mL，分别加入0.20、0.30、0.40和0.50mL标准葡萄糖对照品溶液，测定A490值，计算回收率，考察方法的准确度。回收率＝ （测得A490值－样品中被测成分原本A490值）／加入标准品A490值×100%。

1.3 东北菱粗多糖纯化方法的比较

将多糖水平最高的提取物用以下4种方法进行纯化。

1.3.1 Sevag法 精确称取1.00g东北菱提取物样品，配制成质量浓度为20g·L－1的样品溶液。按氯仿∶正丁醇＝4∶1的比例配制Sevag溶液10mL，与50mL样品溶液混合，充分震荡30min，置于分液漏斗内静止1h，上层液4000r·min－1离心10min，留取上清液，重复上述步骤5次。

1.3.2 三氯乙酸法 精确称取1.00g东北菱提取物样品，配制成质量浓度为20g·L－1的样品溶液。取50mL样品溶液，加入10% 三氯乙酸溶液，调至pH＝3，充分混匀，静置过夜。次日将溶液移入离心管内，4000r·min－1离心10min，弃去沉淀，保留上清液，以待测定。

1.3.3 盐酸法 精确称取1.00g东北菱提取物样品，配制成质量浓度为20g·L－1的样品溶液。取50mL样品溶液，缓慢加入一定体积2mol·L－1盐酸，使溶液pH＝3。混合均匀，静置过夜，次日4000r·min－1离心10min，弃去沉淀，保留上清液。

1.3.4 活性炭法 精确称取1.00g东北菱粗多糖样品，配制成质量浓度为20g·L－1的样品溶液。取20mL样品溶液加入1.00g活性炭粉末，充分混匀，50℃恒温水浴2h，4000r·min－1离心10min。去除活性炭残渣，保留上清液。

1.3.5 多糖水平的测定 经4种方法纯化后的多糖溶液按照1.2.2方法测定多糖水平。

1.3.6 蛋白质水平的测定 考马斯亮蓝 G－250溶液配制：精密称取考马斯亮蓝G－25010.00mg置于100mL容量瓶中，依次加入95%无水乙醇5mL，85% 磷酸10mL，混合均匀，加蒸馏水定容至刻度，避光备用。标准曲线：精确称取牛血清蛋白标准品1.00mg至容量瓶中，加蒸馏水定容至10mL，溶液质量浓度为1g·L－1。精确量取标准牛血清白蛋白溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL置于具塞试管中，补蒸馏水至1.00mL，加考马斯亮蓝 G－250溶液5mL，立即混合均匀，于595nm波长处测定A值。以牛血清蛋白标准品质量浓度为横坐标，A595值为纵坐标建立标准曲线。见图2。

图2 牛血清蛋白标准曲线Fig.2 Standard curve of bovine serum albumin

样品中蛋白质水平的测定：精密吸取上述4种方法处理后得到的提取物溶液各1mL，分别加考马斯亮蓝G－250溶液5mL，以空白试剂为参比，于595nm波长处分别测定A595值，依标准曲线计算样品浓度及蛋白水平。蛋白水平＝A595值对应的蛋白水平／样品的质量×100%。

2 结 果

2.1 东北菱提取物中多糖水平

以甲醇、乙醇和丙酮为溶剂的东北菱提取物中多糖水平分别为29.68%、18.77%和33.69%，以丙酮为溶剂的东北菱提取物中多糖水平最高，故以下实验均以该提取物为样品。对以丙酮为溶剂的东北菱提取物进行回收率测定，结果见表1。

表1 东北菱粗多糖的回收率Tab.1 Recovery rates of raw polysaccharide of northeast water chestnut

2.2 不同方法纯化后东北菱多糖水平

经Sevag法、三氯乙酸法、盐酸法和活性炭法处理后的东北菱提取物溶液中A490值对应的多糖水平 依 次 为 93.059、 86.875、 82.482 和73.315mg·L－1，计算得各东北菱提取物溶液中多 糖 水 平 所 占 比 依 次 为 46.53%、43.44%、41.24%和36.66%。经4种方法处理后的溶液中多糖水平均高于东北菱提取物溶液中多糖水平。这4种方法对菱角粗多糖纯化均有较好的效果，其纯化效果顺序为Sevag法＞三氯乙酸法＞盐酸法＞活性炭法。

2.3 不同方法纯化后东北菱提取液中蛋白质水平

东北菱提取液中蛋白质水平为5.51%，经Sevag法、三氯乙酸法、盐酸法和活性炭法处理后的东北菱提取物溶液中A595值对应的蛋白质水平依次为 56.353、54.125、54.071和55.068mg·L－1，计算得各东北菱提取物溶液中蛋白质水平占比依次为5.64%、5.41%、5.41%和5.51%。经4种方法处理后的东北菱提取溶液中平均蛋白质水平占比均约为5%，总体变化不大。

3 讨 论

东北菱多糖为东北菱中的天然活性成分，为水溶性。在醇、酮等极性强的溶剂中的溶解度较低，因此向溶解了大量多糖的水溶液中加入醇溶剂可使多糖沉淀［11－12］。

本实验用甲醇、乙醇和丙酮3种溶液作为溶剂提取东北菱粗多糖，比较3种提取物中多糖水平，结果显示：以丙酮为溶剂的提取物中多糖水平最高，这与3种溶剂的极性强弱有关联。

多糖的测定方法有苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法［13］。范传颖等［14］对2种方法进行比较，发现苯酚－硫酸法灵敏度高且不受蛋白质存在的影响，测定结果更为准确合理。因此，本实验采用苯酚－硫酸法检测东北菱提取物中多糖水平。

本研究比较了Sevag法、三氯乙酸法、盐酸法和活性炭法4种传统方法的多糖纯化效果，结果显示：4种方法对东北菱粗多糖的纯化均有较好效果，顺序为Sevag法＞三氯乙酸法＞盐酸法＞活性炭法。Sevag法操作条件温和，对糖链破坏较小，且所用试剂常规、廉价，适合东北菱粗多糖的提取；三氯乙酸法和盐酸法纯化粗多糖效果均不如Sevag法；盐酸法中盐酸为强酸，若不严格控制实验条件，经盐酸法脱蛋白后，会降解部分多糖，粗多糖的提取过程中，容易发生氧化反应生成有色色素，从而影响多糖性质；活性炭法是常用的脱色素方法，同时也有吸附蛋白的作用。中草药中的多糖因含有酚型化合物而颜色较深，其中的色素大多呈负性离子，导致活性炭吸附剂脱色效果不明显，且纯化过程中损失多糖较多。

郭育东等［15－17］对苦瓜多糖的脱蛋白质方法进行比较结果显示：无论哪种脱蛋白质方法所得的多糖制品中均存在一部分蛋白质不能被脱掉。

本研究结果显示：4种方法处理后样品中均有约5%的蛋白质成分，与郭育东等［15］的研究结果一致，说明东北菱中蛋白质的存在形式可能是糖蛋白或糖肽，单纯靠这4种传统方法不能使其脱除，如果要获得更为纯化的多糖制品，还需要经过其他一系列的精细分离纯化工艺。

从多糖的生物学功能与其结构的关系来看，东北菱多糖的糖蛋白结构对生物体内的生物活性功能发挥重要作用仍有待于深入研究。

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