心乐胶囊对病毒性心肌炎小鼠MMP-1、TIMP-1蛋白水平的影响*

徐惠梅 崔 欣 海锦歌 路瑞华

（黑龙江省中医药科学院·150036）

病毒性心肌炎是由嗜心肌性病毒感染而发的局限性或弥漫性炎症的心肌疾病。有研究表明其病程中的心室重构不仅与心肌细胞坏死、凋亡和免疫损伤有关，而且与心肌间质胶原纤维的改变密切相关。其中胶原降解系统MMPs的高表达与MMPs/TIMPs的比例失调在病毒性心肌炎心肌间质重构起着重要作用。[1]本研究旨在用中药干预病毒性心肌炎动物模型，在细胞水平观察心乐胶囊对MMPs/TIMPs系统的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 柯萨奇B3型(CVB3)，Nancy株，引自哈尔滨医科大学微生物实验中心。

1.1.2 实验动物 BALB/c雄性小鼠，由哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心提供，3周龄，体重20±2克。合格证号：SCXK(黑) 2008004。

1.1.3 主要试剂及药品 一抗为Rabbit Anti-TIMP-1、Rabbit Anti-MMP-1北京博奥森生物技术有限公司提供。二抗为兔二步法检测试剂盒PV-6001，北京中杉金桥生物技术有限公司提供。心乐胶囊：黑龙江省中医研究院制剂室提供；玉丹荣心丸：上海玉丹药物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备、分组及给药将60只小鼠随机分为6组，每组10只。经统计学处理，组间体重无显著性差异：空白对照组、模型对照组、玉丹荣心丸组、心乐胶囊低、中、高剂量组。除空白组外，后5组小鼠给予500 TCID50 CVB3稀释液0.2ml腹腔注射，每四天注射一次，连续注射四次，建立病毒性心肌炎小鼠模型。注射结束后玉丹荣心丸组按3.51g/kg给予玉丹荣心丸混悬液0.2ml，灌胃日一次；心乐胶囊高、中、低个剂量组分别给予按2.184g/kg、1.092g/kg、0.546g/kg的混悬液0.2ml灌胃日一次；空白对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃日一次， 疗程15天。

1.2.2 指标检测 断颈处死小鼠，取心脏，用4%多聚甲醛液固定后石蜡包埋、切片、DAB显色，如有需要苏木素复染。根据北京中杉金桥生物技术有限公司试剂说明书中抗体免疫组织化学染色结果判断标准，MMP-1、TIMP-1均为细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。

采用APSAP法测定MMP-1、TIMP-1平均阳性染色面积百分比[2]。

1.2.3 统计学处理 实验数据以SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，各组实验数据以(x-±s)表示。总体数据用One-Way ANOVA作统计分析，用LSD检验作各组间均数两两比较。检验显著性水平设定为P＜0.05。

2 结果

2.1 一般情况

除空白组外，其余各组小鼠于感染后2～3天发病，出现精神萎靡、活动减少、饮食减少、耸毛。造模期间各组均有1只小鼠死亡。灌胃治疗开始后，模型组死亡2只，玉丹荣心丸组较心乐胶囊各剂量组小鼠易激惹。其余小鼠症状逐渐减轻，活动较前好转，其中治疗组均较模型组症状轻。空白组无发病及死亡。

2.2 各组心肌组织MMP-1蛋白水平比较

表1 各组心肌组织MMP-1蛋白水平比较

▽▽P ＜0.05；与玉丹荣心丸组比较◆P＜0.01，◆◆P ＜0.05；与心乐胶囊中低剂量组比较▲P＜0.01。

2.3 各组心肌组织TIMP-1蛋白水平比较

表2 各组心肌组织TIMP-1蛋白水平比较

3 讨论

在正常心肌细胞中，MMPs的正常表达与MMPs/TIMPs比例平衡起着非常重要的作用。MMPs 是内源性蛋白水解酶家族，是细胞外基质的破坏与降解过程中重要作用的生理调节因子。组织金属蛋白酶抑制因子( TIMP) 是MMPs的特异性抑制物。TIMP与MMP以1：1的比例形成MMP- TIMP复合体，从而阻断MMP与底物结合，抑制MMP的活性，降低胶原的降解。

在整个病毒性心肌炎的病程中，心肌胶原的改变是由修复性纤维化到反应性纤维化的动态演变过程，急性期是修复性纤维化以Ⅰ型胶原增生为主，恢复期修复性纤维化与反应性纤维化并存，发展至慢性期的反应性纤维化以Ⅲ型胶原增生为主。[3]本实验研究的MMP-1的主要功能则为降解Ⅰ、Ⅲ型胶原，其在病毒性心肌炎整个病程中持续高表达直至恢复期。TIMP-1作为其特异性抑制因子，可阻断其与底物结合，从而抑制胶原的溶解， 延缓心室重构的发展。

本实验中，与空白对照组相比，模型对照组的MMP-1水平明显升高（P＜0.01），TIMP-1水平明显下降（P＜0.01）。提示MMP-1活性升高，TIMP-1活性降低，两者平衡失调，胶原降解增加，促使心肌纤维化的发生。与模型组相比，阳性药对照组MMP-1水平下降（P＜0.05），而心乐胶囊各剂量组MMP-1水平下降明显（P＜0.01），与低剂量组相比，心乐胶囊高剂量组MMP-1水平下降更明显（P＜0.05）。与模型组相比，阳性药对照组TIMP-1水平升高（P＜0.05），而心乐胶囊各剂量组TIMP-1水平升高明显（P＜0.01），与低剂量组相比，心乐胶囊高剂量组TIMP-1水平升高更明显（P＜0.05）。以上结果提示玉丹荣心丸与心乐胶囊均能使MMP-1水平降低，促进TIMP-1水平升高，减小MMP-1/TIMP-1的比值，从而减少心肌胶原蛋白过度降解，延缓心肌纤维化进程。与低剂量组比，心乐胶囊高剂量组效果更为明显，表明心乐胶囊的抗心肌纤维化作用可能与剂量呈正相关作用。

[1] 韩奇杰，等. 病毒性心肌炎引起心肌纤维化机制探讨[J].国际内科学杂志，2009，36：512-515.

[2] 姜洋，金小明，屠康. 平均阳性染色面积百分比法分析免疫组化结果初探[J].生物医学工程学杂志，2007；24（3）：650-653.

[3] 王娟，程志青.基质金属蛋白酶及其组织抑制剂与病毒性心肌炎心肌纤维化[J].中国心血管杂志，2007；12：467-469.