紫菀药材的HPLC指纹图谱研究

曹贵阳 张 瑞 霍金海

（黑龙江省中医药科学院·150036）

紫菀为常用中药，中国药典（2010版）收载其来源为菊科植物紫菀（Aster tataricusL.f.）的干燥根茎及根，具润肺下气、镇咳祛痰之功效，主治气逆咳嗽，痰吐不利、肺虚久咳、痰中带血等症，在中医临床处方及中成药中用量很大。但目前紫菀评价还停留在单一成分含量测定，急需一种全面评价药材质量的技术方法。本文所建立指纹图谱是以3种已知化合物为标记峰，以14个共有峰作为特征峰的紫菀药材指纹图谱，其信息量多，方法简便，重现性好，并所建立指纹谱与药效密切相关，使所建立的方法更行之有效。

1 仪器与试药

1.1 药材采集

本研究收集了10个不同产地不同采收期的紫菀根及根茎药材样品（Aster tataricusL.f.）来源见表1-1（经生药学鉴定）。晾干，切成小段，置烘箱内，于40℃烘干8 h，取出，用粉碎机粉碎，过3号筛，置干燥器中，备用。本品应符合中国药典中药材标准2000年版紫菀项下有关规定。

1.2 仪器

1100型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司 )，Shiseido C18色 谱 柱 (4.6mm×250mm，5μm)，Agelient C18色 谱柱 (4.6mm×250mm，5μm)， Diamonsil钻 石 C18色 谱 柱（4.6mm×250mm，5μm）；KQ-300DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；ATC2-5-U型超纯水系统（重庆艾科浦公司）；BP211D型电子天平 （德国Sartorius公司）。

表1-1样品产地

4 2012.秋 吉林 9 2009.秋 山西5 2009.秋 辽宁 10 2009 秋 甘肃

1.3 试药

乙腈、甲醇为色谱纯（美国迪马公司）；冰乙酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为自制超纯水；其余试剂均为分析纯，（沈阳化学试剂厂）；

1.4 参照物

紫菀酮对照品（批号111581-200604）、槲皮素对照品（批号100081-200406）、山奈酚（批号110861-200406）、紫菀对照药材（批号0956-9903）槲皮素由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：迪马C18色谱柱 （4.6mm×250mm，5μm）；流动相：0.02%磷酸溶液-乙腈；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：200nm；进样量：20 μl，梯度洗脱条件：0-10分钟，90：10（水：乙腈）；10-15分钟，78：12（水：乙腈）；15-30分钟77：23（水：乙腈）；30-43分钟，65：35（水：乙腈）；43-50分钟，40：60（水：乙腈）；50-60分钟，35：65（水：乙腈）。

2.2 供试品溶液的制备

取紫菀药材(过20目筛)，精密称取药材2g，用100%甲醇超声提取30min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 对照品的制备

取紫菀酮、槲皮素、山奈酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成1mL中含1mg的溶液，即得。

2.4 指纹图谱的方法学考察

2.4.1 精密度试验 取编号为6的紫苑药材，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μl，连续进样6次，按照2.1项下色谱条件进行测定，得到共有色谱峰面积及保留时间。结果峰面积及保留时间RSD均小于3%，说明此方法的精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取编号为6的紫苑药材，按2.2项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按照2.1项下色谱条件进行测定，测定主要色谱峰面积。结果峰面积及保留时间RSD均小于5%，表明方法重复性符合要求。

2.4.3 稳定性试验 取编号为6的紫苑药材，按2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，分别在0、4、8、16、24h，测定指纹图谱，测定主要色谱峰面积。峰面积及保留时间RSD均小于3%，表明供试品溶液在24小时内稳定。

2.5 紫菀指纹图谱的建立与分析

2.5.1 指纹图谱的采集 精密称取10批紫苑药材粉末各2.0g，分别按照2.2项方法制备供试品溶液，依据2.1项下色谱条件，进样20μl，将各批次紫菀药材的HPLC-UC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版，设定匹配模板，生成对照指纹图谱。结果见图6-1。

图6-1不同产地紫菀药材指纹图谱的比较

2.5.2 指纹图谱共有峰的确定 用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版(国家药典委员会)比较不同产地样品的色谱图，其中有14个色谱峰是共有的，确定为共有峰(图5-1)。校正后的保留时间分别为8.725、10.034、21.336、23.474、25.73、26.147、29.225、30.568、34.145、42.516、52.339、58.046、61.598、63.421min。

2.5.3 紫菀指纹图谱相似度 按上述指纹图谱条件，制备紫菀供试品溶液，进样20ul，计算10批不同产地紫菀样品的相似度，计算结果见表6-1。

表6-1相似度软件评价结果

2.6 小结

（1）采用相似度评价系统软件，比较紫菀所有测定和记录的色谱图，我们分析了不同产地紫菀的HPLC指纹图谱，目的在于更全面系统地评价紫菀的质量。实验过程中发现，紫尤其是山东产地相似度最差。表明紫菀个别样本之间相似性较差，说明不同的生长环境会对紫菀的质量有一定的影响，仍然有一定产地药材偏离整体水平较远，在选择药材产地时应予以注意，缩小药材的产地范围，无疑对保证紫菀的质量一致具重要作用。

（2）由于中药成分复杂，在流动相及梯度选择上，用单一流动难以实现各色谱峰的基线分离，而梯度洗脱可以使不同极性的各成分有效分离。实验表明，冰醋酸加入到流动相中可以改善峰形，从而改善分离效果。通过大量的对比实验表明，1%冰醋酸溶液-乙腈梯度洗脱分离效果良好，产生满意的HPLC色谱图，其它流动相系统组合均不能使其成分得到很好的分离。