氯沙坦对静态牵张刺激导致肥大心室肌细胞中L型钙离子通道表达的影响

杨君 杨龙 郑亚西 牛晨光 田龙海 夏桂玲 田水 张羽坤 唐倩

（1.贵阳医学院，贵州 贵阳 550004；2.贵州省人民医院心内科，贵州 贵阳 550002；3.河南大学第一附属医院，河南 郑州 450000；4.贵州航天医院心内科，贵州 遵义 563003；5.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004）

心力衰竭（心衰）发病率及死亡率目前仍居高不下，是心源性死亡的主要病因之一，心衰时，受损心肌通过改变心肌收缩力、导致心肌肥大及电生理的重构起到代偿作用［1－2］。心肌肥大是心脏长期承受过重负荷，靠质量增加、收缩力加强产生的一种缓慢而有效的代偿方式［3］。这种代偿在维持充足心搏量的同时会增加耗氧量，导致组织结构重构、细胞膜电位改变等，从而导致和促进心力衰竭，诱导心律失常［4］。肥大心肌细胞会引起大量第二信使相关通路的激活，其中血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）信号的激活与心肌肥大之间存在密切相互作用［5］。肾素－血管紧张素－醛固酮系统（RAS）激活增强血管收缩、促进机体水钠潴留，使回心血量和有效血容量增加；心脏前、后负荷的显著增加进一步恶化心力衰竭。因此，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或AT1R 拮抗剂（ARB）能在有效降低血压的同时起到保护心肌肥大的作用［6］。研究［7］表明，AT1R 拮 抗剂氯沙坦不仅可降低收缩压，并且阻止心肌肥大。因而本研究拟通过静态牵张刺激体外培养的心室肌细胞，用血管紧张素受体阻断剂氯沙坦干预，探讨氯沙坦在静态牵张刺激导致的心室肌细胞L－型钙离子通道改变中的作用［8］。

1 资料与方法

1.1 临床资料 胎牛血清（FBS）和DMEM 高糖培养基由Gbico 公司生产，胰酶和Ⅱ型胶原酶购自Sigma公司，免疫组化试剂盒购自碧云天公司，蛋白－DNA－mRNA 共提取试剂盒购自Omega生物技术公组司，Cav1.2组抗组体组购组自Abcam组公组司，SYBR Premix Ex Taq购自Takara公司，α－横纹肌动蛋白（α－SCA）单克隆抗体购自博士德生物工程有限公司，其他试剂均为国产分析纯以上级别。

1.2 心室肌细胞培养与鉴定 出生1d的清洁级SD 大鼠用乙醚气雾麻醉。取近心尖中下2／3的心室组织，洗去血液，剪至约1mm×1mm 的组织块。用含0.05%胰酶和80mol／LⅡ型胶原酶的消化液消化，结合差速贴壁法获得心室肌细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中，用含10%FBS的DMEM 培养基培养。通过细胞形态和α－SCA 阳性染色情况鉴定心室肌细胞。

1.3 实验分组与处理 细胞于静态牵张装置硅胶模上贴壁培养24h，更换含5%FBS的DMEM 培养基，分为4组。（1）对照组：不予干预；（2）牵张组：较基础培养状态增加20%硅胶模面积；（3）氯沙坦组：在培养液中加入氯沙坦10μmol／L；（4）静态牵张＋氯沙坦组：在培养液中加入氯沙坦10μmol／L 干预2h后，增加20%硅胶膜面积。各组细胞分组培养后进行检测。

1.4 牵张有效性鉴定 按试剂盒说明检测细胞培养上清中BNP 水平；测定细胞DNA 和蛋白含量，计算蛋白／DNA 比值。结晶紫染色细胞并用软件统计细胞面积大小。

1.5 基因mRNA 水平的检测 采用Oligo 6.0软件设计引物（序列见表1）。Trizol法提取细胞总mRNA，按SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明检测基因mRNA 相对表达量。

表1 Cav1.2和GAPDH RT－PCR引物序列

1.6 蛋白质印迹法 提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。取50μg总蛋白上样，电泳后转移蛋白至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭1h，加入相应一抗4 ℃孵育过夜。充分漂洗后加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1h。充分漂洗后显影、摄片并进行条带灰度定量测定。

1.7 统计学处理 实验数据采用Epidata 3.1软件建立数据库，使用SPSS 19.0进行数据分析。计数资料以（±s）表示。组间总体差异性比较用方差分析，多处理组与对照组比较用t检验，未计划两组间比较用q检验。检验水准α=0.05，如无特殊说明，P值表示双侧概率，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心室肌细胞培养与鉴定 倒置显微镜下可见心室肌细胞呈长梭形。心室肌细胞免疫组化染色呈阳性反应，胞浆内清晰可见棕褐色颗粒物，成纤维细胞呈现阴性，可见大量细胞核。见图1。

图1 心室肌细胞、成纤维细胞α－SCA 抗体免疫组化染色（×200）

2.2 牵张有效性 心室肌细胞受静态牵张后结果显示刺激24h的细胞蛋白／DNA 比值明显增加（P＜0.001，n=3），而Losar干预可有效抑制此效应（P＜0.001，n=3，图2）。静态牵张心肌细胞使得其ANP基因表达（P＜0.01，n=3，图3）均明显增加。

图2 4组心室肌细胞蛋白／DNA 比值（＊P＜0.001）

图3 对照组与牵张组ANP基因表达比（＊P＜0.01）

2.3 L－型钙离子通道基因表达情况 RT－PCR 技术加荧光定量法检测样本中初始目标mRNA 含量，结果显示静态牵张刺激显著下调心室肌细胞Cav 1.2的mRNA 表达（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制该效应（P＜0.05，n=3，图4）。

图4 牵张刺激心室肌细胞降低Cav1.2的

2.4 L－型钙离子通道蛋白表达情况 WB 技术检测蛋白表达，结果显示静态牵张刺激显著下调心室肌细胞Cav1.2的蛋白表达（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制该效应（P＜0.05，n=3，图5，6）。

图5 Cav1.2蛋白表达半定量分析结果（＊P＜0.05；＊＊P＜0.01）

图6 免疫印迹检测Cav1.2蛋白表达

3 讨论

3.1 静态牵张刺激致肥大心室肌细胞模型评价本实验采用体外培养原代心室肌细胞，结合静态牵张模仿过负荷导致的心室肌肥大，有效避免体内神经－体液因素的影响。若排除了机体复杂因素的干扰，即可较为单一的研究目标通路。试验中牵张组心室肌细胞蛋白／DNA 比值、ANP基因表达和细胞面积明显高于对照组，证明静态牵张刺激导致心室肌细胞肥大模型建立成功，可用于后续实验。

3.2 肥大心室肌细胞L－型钙离子通道Cav1.2mRNA 和蛋白表达情况及AT1R信号调控作用 心力衰竭时部分离子通道表达发生改变，证明心衰是心律失常发生的重要独立因素。有研究［9－10］指出心衰时心房细胞ICa－L降低，基因表达水平降低，但较少涉及蛋白水平及AT1R 信号调控。本研究发现与正常组比较，静态牵张组心室肌细胞Cav1.2基因及蛋白表达均明显受到抑制，这种现象能被AT1R阻滞剂Losar所抑制。证明牵张刺激可能通过激活AT1R信号通路导致心室肌细胞肥大，同时还通过该通路下调Cav1.2的表达。Losar可抑制牵张刺激所致的心室肌细胞肥大，这也提示了RAS参与心室肌细胞的重构过程。心衰导致RAS系统激活，可使心律加快进而钙离子内流增加，超载的钙离子可以反馈抑制L－型钙离子通道［11］。进一步影响细胞内外钙、钾分布，心肌细胞电位不稳定，诱发心律失常。

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