HPLC法测定茵陈提取物中绿原酸的含量

张昀 张艳萍 何峰

（贵州瑞和制药有限公司，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004）

舒肝宁注射液是由茵陈提取物、栀子提取物、板蓝根提取物等制备而成的中药复方制剂，主要功效为清热解毒，保肝护肝［1－2］，所含成份较为复杂，因此为了控制舒肝宁注射液成品质量的均一性，对于其组方中各种提取物的质量控制尤为重要。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血脂、清除自由基等作用［3］。本文以舒肝宁注射液中君药茵陈提取物为研究对象，用高效液相色谱测定绿原酸的含量，用于茵陈提取物及舒肝宁成品的质量控制。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（岛津LC－10AT，Sepu3000色谱工作站，SPD－10A 紫外检测器）；电子天平（GR－202型，日本A＆D 公司）；绿原酸对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号：0753－200111）；甲醇（分析纯）；乙腈（色谱级）；磷酸（分析纯）；茵陈提取物（贵州瑞和制药有限公司，批 号：T－Y030409、TY030512、T－Y030701、T－Y030828、T－Y031022、TY031112、T－Y040218、T－Y040902、T－Y040905、TY040909）。

2 方法与结果［4］

2.1 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含6μg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备 取茵陈饮片加水煎煮2次，第1次加饮片8倍量的水，煎煮1.5h；第2次加饮片6倍量水，煎煮1h，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.20～1.25（50 ℃）。分别加入乙醇使含醇量达到60%、80%，减压回收乙醇浓缩至相对密度为1.25～1.30（50组℃）。按每30g组浸组膏加组水组至100g组计算进行水沉。将水沉物115 ℃热处理45min，冷至室温，置于0～10 ℃冷藏不少于10d。水沉液用5μm 钛棒过滤，除去沉淀，即得茵陈提取物过滤液。取茵陈提取液过滤，精密吸取滤液1 mL，置50mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密吸取2 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3 空白溶液制备 取制备供试品溶液的溶剂甲醇，滤过，即得。

2.4 色谱条件与系统适用性试验 迪马C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；流动相：乙腈－0.4%磷酸（10∶90）；检测波长327nm；柱温30 ℃；流速1.0mL／min。理论塔板数按绿原酸计算不低于3 000，分离度＞1.5。

2.5 专属性试验 精密吸取绿原酸对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各10μL，按上述色谱条件测定。结果表明空白溶液在与绿原酸对照品及供试品溶液相同保留时间处未显干扰色谱峰。见图1。

图1 专属性试验图谱

2.6 线性关系考察 用对照品溶液进行线性范围试验，以峰面积为纵坐标，对照品溶液进样量为横坐标作线性回归，回归方程为Y=1 295 313.5178X－121.1 598，相关系数r为0.9 999。结果表明进样量在0.0 229～0.137μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验 精密吸取浓度为6.8 740μg／mL的绿原酸对照品溶液10μL，重复进样6次，峰面积平均值为88 283，RSD为0.84%，上述试验结果表明精密度良好。

2.8 稳定性试验 精密吸取按“供试品溶液的制备”法新处理的样液T－Y040218（n=3），分别于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h（室温下放置，每次间隔进样时样品溶液避光保存）依法测定，记录峰面积，结果6次进样绿原酸峰面积的RSD 为1.14%，表明样品在5h内稳定。见表1。

表1 稳定性试验结果（±s，n=3）

表1 稳定性试验结果（±s，n=3）

2.9 重复性试验 取茵陈提取物T－Y030701，按“供试品溶液的制备”方法制备6份供试品溶液。按上述色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，结果RSD 为0.19%。试验结果表明，重复性良好。见表2。

表2 重复性试验结果（±s，n=3）

表2 重复性试验结果（±s，n=3）

2.10 回收率试验 精密吸取已知绿原酸含量的同批号（T－Y040218）样品6份，每份0.5mL，置50mL棕色量瓶中，分别精密加入对照品溶液（1.718mg／mL）1mL，加甲醇稀释至刻度；再精密吸取2mL，置25mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件测定计算绿原酸回收率，结果表明绿原酸的平均回收率为98.0%，RSD 为1.77%（n=6）。见表3。

表3 回收率试验结果（n=6）

2.11 样品测定 按上述色谱条件测定10批茵陈提取物中绿原酸的含量（表4）。10批茵陈提取物中绿原酸的平均含量根据实际生产需要按总固体折算为17.59mg／g。

表4 样品的含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择 取绿原酸对照品适量加甲醇使溶解，制成每1mL含1 mg的溶液。在190～400nm 波长段进行紫外光谱扫描20min，结果绿原酸在波长327nm 处有最大吸收，故选择测定波长为327nm。

3.2 流动相的选择 实验中对流动相进行了选择，其中使用乙腈－水（10∶90）峰型差，样品分不开；使用乙腈－0.3%磷酸溶液（10∶90），峰型差，样品分离度差；乙腈－0.4%磷酸溶液（9∶91），峰型好但出峰时间晚。结果选用本实验条件下的乙腈－0.4%磷酸（10∶90），峰型好，样品分离度好，分离度＞1.5，出峰时间合适。

本实验结合药典建立了茵陈提取物中绿原酸的含量测定方法，并进行了方法学考察，结果表明所建立的方法结果可靠，10批茵陈提取物样品中绿原酸的含量在13.17～20.42mg／g之间，本方法可为进一步提升茵陈提取物和舒肝宁注射液的质量标准提供试验参考。

［1］关妮.舒肝宁注射液临床应用进展［J］.医学理论与实践，2014，27（10）：1291－1295.

［2］王云，罗天永.舒肝宁注射液治疗黄疸型肝炎的临床效果观察［J］.护士进修杂志，2010，25（8）：744－745.

［3］邓良，袁华，喻宗沅.绿原酸的研究进展［J］.化学与生物工程，2005，1（7）：4－6.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：223.