富含共轭亚油酸酸奶的特性分析*

金磊，刘萍，李海星，柯颖笑，孙丽婷，刘晓华

1(南昌大学中德联合研究院，食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌，330047)

2(扬州市第一人民医院，江苏 扬州，225009)

随着人们生活水平的提高，乳品的需求量也日益增多。生产高品质、多类型乳制品是乳品企业开拓市场、促进消费的重要途径。设计和开发具有特定功能的乳制品已成为一大研究热点［1－2］。共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一组十八碳共轭二烯酸的总称，包含多种位置和几何异构体。研究表明，CLA的特定异构体具有促进健康的保健功能，如抗癌、抗动脉粥样硬化、增强肌体免疫力、调节脂肪代谢及促进骨组织代谢等［3］。乳及乳制品是膳食中天然CLA的最主要来源，但是每100 mL牛奶中CLA的含量通常小于10 mg［4］，人们每天通过饮食摄入的CLA量与其能在体内产生显著保健功效的需要量(3 g/d)仍有较大差距。因此，如何从食物中获取更多的CLA来满足人体健康的需要，正受到人们的重点关注［5］。

有研究报道指出，增加食物中CLA含量的方法有两种:一是通过改变饲料配方和饲养方法，提高畜产品中CLA的含量;另一种方法是在食品中，尤其是在乳制品中，进行 CLA 的强化，提高 CLA 的含量［6－7］。因此，本研究通过在脱脂乳中添加亚油酸，利用乳酸菌发酵使其转化成CLA，在保证酸奶特征指标的同时，获得富含CLA的新型保健功能酸奶产品。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

脱脂乳粉(黑龙江省完达山乳业有限公司)，亚油酸(自制，纯度＞95%)，植物乳杆菌R6(本实验室分离保藏)，乙醇、NaOH、正己烷均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

数字黏度计(SNB-2)，上海尼润智能科技有限公司;电子天平(MP-500B)，上海天平总厂;电热恒温水浴锅(HH-SH-4)，北京长安科学仪器厂;碱式滴定管，离心机(TGL-16G)，上海安亭科学仪器厂;恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂;液相色谱仪(1200)，美国安捷伦。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

将植物乳杆菌R6菌种从甘油管中取出，转接于MRS液体培养基中进行活化和扩大培养后作为发酵菌种。

1.3.2 酸奶的制备

将脱脂乳粉加水配制成10%的脱脂乳，每试管5 mL，85℃灭菌30 min，冷却至合适的温度接入植物乳杆菌R6菌种，接种量为体积分数5%。然后分别向每组试管中加入0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.125%亚油酸，混合均匀，放置在37℃的恒温培养箱中培养。

1.3.3 实验分组

实验分别设置了5个亚油酸添加量(0.025%、0.05%、0.075%、0.1%和0.125%)，每组分别发酵24、36、48 和 60 h。

1.3.4 黏度的测定

用SNB-2数字黏度计进行测定，选用4号转子，转速60 r/min，重复测定叁3次取平均值。

1.3.5 滴定酸度的测定

取1 mL酸奶于小烧杯中并加入3 mL蒸馏水，加入1滴1%的酚酞做指示剂，用0.01 mol/L NaOH溶液准确滴定，记录消耗NaOH溶液的体积。通过计算测得酸奶的滴定酸度，用吉尔涅尔度(°T)表示［8］。

1.3.6 保水性的测定

称取约3.50 g(记为W)酸奶于离心管中，以3 000×g离心20 min后，吸除上清液，称残余物的质量(记为W1)［9］。

1.3.7 乳酸菌活菌数的测定

取待测酸奶100 μL于1.5 mL离心管中，加入900 μL无菌水，混合均匀，依此方法做梯度稀释，然后取100 μL涂布MRS平板，放入恒温培养箱中37℃培养48 h后，进行菌落计数。

1.3.8 MRS培养基的配制

大豆蛋白胨5 g，胰蛋白胨5 g，牛肉粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖 5 g，乙酸钠 5 g，柠檬酸二胺 2 g，K2HPO42 g，土温 80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g，Mn-SO4·H2O 0.05 g，加蒸馏水至 1 L，调节 pH 至6.8［10］。向上述液体培养基中加入琼脂15 g即得MRS固体培养基。

1.3.9 CLA的分析测定

CLA含量的测定采用高效液相色谱法，色谱柱为ChromSpher 5 Lipids(Chrompack)，流动相为V(正己烷)∶V(乙腈)=99.9∶0.1，流量为 1.0 mL/min，检测波长为230 nm。CLA异构体的确定采用毛细管电泳法［11］。

2 结果与分析

2.1 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶黏度的影响

亚油酸是植物乳杆菌R6合成CLA的底物，本实验通过在脱脂奶中添加不同浓度的亚油酸，研究其对酸奶黏度的影响。由图1可见，当脱脂奶中的亚油酸添加量为0.025% ～0.075%时，酸奶黏度随亚油酸浓度和发酵时间呈逐渐上升趋势，最大黏度值达2 950 mPa·s。而当亚油酸添加量在 0.1% ～0.125%时，酸奶黏度却逐渐下降，最低值为2 550 mPa·s。有研究表明，亚油酸对乳酸菌的生长有抑制作用［12］。本研究发现脱脂奶中的蛋白质能使乳酸菌免受低浓度亚油酸的抑制作用，但当亚油酸浓度超过0.1%时，乳酸菌的生长仍然会受到一定程度的抑制，从而出现酸奶黏度下降的现象。

图1 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶黏度的影响Fig.1 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on viscosity of yogurt

酸奶在发酵过程中乳酸菌会将乳糖转化成乳酸，当pH值降至酪蛋白的等电点时，牛奶中的酪蛋白开始凝结，形成具有立体结构的凝胶体系，呈现酸奶特有的黏稠质地。酸奶的酸度和蛋白水解程度等对酸奶的黏度影响较大，同时乳酸菌在生长过程中产生的代谢产物如胞外多糖与酪蛋白的相互作用也会对酸奶的黏度产生影响［13］。酸奶的黏度在感官上主要表现为稠厚感，较大的黏度可增强酸奶的稳定性，防止乳清析出［14］。通过测定黏度，本研究也发现随着酸奶黏度的增加，其乳清的析出相应减少。

2.2 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶酸度的影响

酸奶的总酸度是衡量其品质的重要指标之一，在酸奶发酵过程中，随着乳酸菌的生长繁殖，乳酸不断在酸奶中累积，总酸度随发酵时间的增加而增大［15］。本研究发现，发酵24 h的酸奶酸度较低，在66～75°T之间，随着发酵时间延长，酸奶酸度逐渐升高，最高达到115°T(图2)。以发酵36 h的酸奶为例，当亚油酸添加量在0.025% ～0.125%时，酸奶的酸度为75～85°T，整体变化趋势比较平缓，表明亚油酸浓度对酸奶酸度的影响较小。

消费者对酸奶酸度选择范围较广，一般为80～130°T。目前，酸奶普遍采用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌株发酵，由于菌体生长快、产酸高，为获得较好的口感，通常只发酵6 h即进入冷藏后发酵。鉴于本研究中添加了亚油酸，菌体生长受到抑制，同时为了提高酸奶中CLA的含量，发酵时间比传统生产方法有所延长。发酵36 h酸奶的酸度为75～85°T，酸度适宜，符合消费者的喜好和要求。此外，有报道酸奶在贮存过程中酸度会越来越高，即出现后酸化现象［16］。本研究将发酵后的酸奶4℃冷藏7 d，未见酸度显著升高，这可能是在前发酵时乳糖已被植物乳杆菌R6充分利用所致。

图2 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶酸度的影响Fig.2 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on acidity of yogurt

2.3 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶保水性的影响

乳清析出、凝乳不结实是凝固型酸奶中普遍存在的产品缺陷之一。Lucey等研究了乳蛋白凝胶的结构和物理性质，指出乳清析出可能和酸奶的蛋白凝胶有很大关系［17－18］。酸奶的保水性与酸奶中的乳清析出和凝胶结构的强度有关，保水性是评价酸奶稳定性的一个重要指标。本实验研究了亚油酸添加量和发酵时间对酸奶保水性的影响。由图3可见，亚油酸添加量对酸奶的保水性影响较小，而发酵时间对保水性的影响较大。发酵36 h以上时，不同亚油酸添加量酸奶的保水性均在43%～52%之间，符合产品的质量要求。而当只发酵24 h时，酸奶的保水性最高仅为35%，这可能是由于发酵时间偏短，产酸偏少导致脱脂乳中酪蛋白凝结不充分所引起。

图3 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶保水性的影响Fig.3 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on water retention of yogurt

2.4 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶活菌数的影响

乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性菌，是一种人体益生菌。研究发现，乳酸菌有降胆固醇、降血压和调节肠道微生态等多种保健作用，因此乳酸菌也常被作为益生菌添加在酸奶中［19］。国家质量监督检验检疫总局发布的酸乳国家标准中规定，乳酸菌数不得低于1×106CFU/mL。由此可见，酸奶中的乳酸菌数已被列入国家强制检测的一项重要指标。

通过研究发现，当酸奶中亚油酸添加量在0.025%～0.075%时，乳酸菌活菌数呈逐渐上升趋势，而当亚油酸添加量为0.1% ～0.125%时，活菌数逐渐降低(图4)。以发酵36 h的酸奶为例，亚油酸添加量在0.025% ～0.075%时，活菌数从4.4×108CFU/mL上升到5.7×108CFU/ML，而当亚油酸添加量从0.1%增加至0.125%时，活菌数从5.7×108cfu/mL下降到3.3×108CFU/mL。出现这种结果的原因可能是当亚油酸添加量高于0.1%，会对乳酸菌的生长产生显著抑制作用。本研究中乳酸菌活菌数均高于2.0×108CFU/mL，符合酸乳国家标准。

图4 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶活菌数的影响Fig.4 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on number of viable count of yogurt

2.5 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶中CLA含量的影响

CLA在2009年被国家卫生部批准为新资源食品，可以直接服用或者添加到各种乳制品中。它具有显著的抗肿瘤、降低血脂、抗动脉粥样硬化、增加肌肉、提高免疫力、防治糖尿病等多种重要的生理功能［20－21］。在美国，CLA 早已被开发成减肥保健品。植物乳杆菌R6是本实验室从牛瘤胃中分离到的具有生物合成CLA的菌株，鉴于CLA的诸多保健功能，本研究在脱脂奶中添加亚油酸，通过乳酸菌发酵来生产富含CLA的酸奶。

由图5可见，随着亚油酸添加量的增加，酸奶中生成的CLA的含量总体呈上升趋势。当亚油酸添加量为0.125%时，亚油酸的转化率却比0.1%时略低，这可能是高浓度亚油酸抑制了菌体生长，造成亚油酸异构酶比活性降低所致。当脱脂乳中亚油酸添加量为0.1%，发酵36 h时，酸奶CLA的含量达到0.9 mg/mL。通过毛细管电泳方法对酸奶中的CLA进一步分析，发现其主要成分为c9，t11-CLA(峰1)，含量大于75%(图6)。Lin等报道了几种乳酸菌具有将亚油酸转化为CLA的能力，包含c9，t11-CLA和t10，c12-CLA两种异构体，表明乳酸菌具有选择性合成CLA异构体的特点［22］。本研究通过植物乳杆菌R6单菌株发酵可以获得富含CLA的酸奶，为缩短发酵时间，还需对植物乳杆菌R6与保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌株的发酵特性进行更深入细致的研究。

图5 亚油酸浓度和发酵时间对酸奶中CLA含量的影响Fig.5 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on the content of CLA of yogurt

图6 酸奶中CLA的毛细管电泳色谱图Fig.6 Chromatography of CLA in yogurt by capillary electrophoresis

3 结论

通过测定发酵酸奶的黏度、酸度、保水性、活菌数和CLA的含量，本研究发现向脱脂奶中添加亚油酸，利用乳酸菌发酵可以生产富含CLA的新型酸奶。通过植物乳杆菌R6单菌株发酵，可获得品质优良的酸奶产品，其中CLA的含量高达0.9 mg/mL，远高于天然食物中的含量。本研究所得的新产品将酸奶的营养与CLA的保健功能集于一体，既丰富了酸奶的品种，也提高了酸奶的保健功能，满足了人们对高品质产品的需求。

［1］ 刘天睿.我国农村乳制品消费需求影响因素研究［J］.中国乳业，2010(7):17－19.

［2］ 顾佳升.乳品标准体系中的术语和工艺过程标准［J］.中国乳业，2009(11):14－17.

［3］ 潘群文，美珍.海篷子籽油制备共轭亚油酸及其组分分析［J］.中国粮油学报，2012，27(2):43－46.

［4］ Kelly M L，Kolover E S，Bauman D E，et al.Effect of intake of pasture on concentrations of conjugated linoleic acid in milk of lactating cows［J］.Journal Dairy Sci，1998，81(6):1 630－1 636.

［5］ 齐士朋，徐尔尼，李垚.乳酸菌UV3-9包埋固定化技术发酵产共轭亚油酸［J］.食品与发酵工业，2012，38(11):36－41.

［6］ 罗玉芬.共轭亚油酸高产菌株的筛选、鉴定、培养基和发酵条件优化［D］.南昌:南昌大学，2011.

［7］ 李垚.嗜酸乳杆菌静息细胞转化菜籽油生成共轭亚油酸的研究［D］.南昌:南昌大学，2013.

［8］ 叶向库，刘汉勋，贺红军.常温下市售酸奶乳酸菌数和pH 值的变化研究［J］.食品科技，2005，11(2):52 －54.

［9］ Remeuf F，Mohammed S，Sodini I，et al.Preliminary observations on the effects of milk fortification and heating on microstructure and physical properties of stirred yogurt［J］.International Dairy Journal，2003，13(9):73 －782.

［10］ 林莹，道芳，旭清.酸奶中乳酸菌稳定性的研究［J］.中国酿造，2011(4):61－64.

［11］ LIU X H，CAO Y S，CHEN Y.Separation of conjugated linoleic acid isomers by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography［J］.J Chromatogr A，2005，1095(1－2):197－200.

［12］ LIU P，SHEN S，RUAN H，et al.Production of conjugated linoleic acids byLactobacillus plantarumstrains isolated from naturally fermented Chinese pickles［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2011，12(11)，923 －930.

［13］ Philipe D，Beat M.Aplications of exopolysaccharides in the dairy industry ［J］.Internal Dairy Journal，2001，11(9):759－767.

［14］ 贺静，张静，卢星达，等.酸奶黏度特性评价方法的研究［J］.食品工业，2011(3):4－6.

［15］ 赵晓丽，李洁慧，宫春波，等.稳定剂添加对发酵型酸奶发酵效果的影响［J］.中国食品添加剂，2011(1):182－186.

［16］ 赵鑫，赵洪双.不同比例的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌对酸奶品质的影响［J］.农产品加工，2009(3):177－180.

［17］ Lucey J A.Formation and physical properties of milk protein gels［J］.Journal Dairy Sci，2002，85(2):281 － 294.

［18］ Lucey J A，Singh H.Formation and physical properties of acid milk gels:a review［J］.Food Research International，1998，30(7):529 －542.

［19］ 李国芝，武建新，苏东海，等.乳酸菌的研究进展［J］.中国乳业，2012(1):58－60.

［20］ Botelho A P，Santos-Zago L F，Oliveira A C.Effect of conjugated linoleic acid supplementation on lipoprotein lipase activity in 3T3-L1 adipocyte culture［J］.Brazilian J Nutr，2009，22(5):767 －771.

［21］ 许浮萍，李燕羽，杨丽娟，等.共轭亚油酸功能油脂安全毒理学评价［J］.中国油脂，2013(9):36－40.

［22］ Dianoczki C，Kovari J，Novak L，et al.Method for the preparation of conjugated linoleic acid［P］.US 2007/0078274A1.2007.