虾头蛋白酶解对热反应型虾味香精风味特征的影响*

李冬梅，李欢，李世伟，孙彤，董志俭，励建荣

1(渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州，121013)2(江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州，225300)

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国对虾虾头冻干粉，实验室自制;风味蛋白酶(Flavorzyme)，500 LAPU/g，诺维信公司;复合蛋白酶(Protamex)，1.5 AU/g，诺维信公司;碱性蛋白酶(Alkaline protease)，200 u/mg，上海华蓝化学科技有限公司;木瓜蛋白酶(Papain)，100 u/mg，上海如吉生物科技发展有限公司;中性蛋白酶(Neutral protease)，200 u/mg，上海华蓝化学科技有限公司;木糖，食品级。

PB-10 pH计，赛多利斯公司;赛康BL301B3绞肉机，上海赛康电器有限公司;油浴锅，上海申安医疗器械厂;固相微萃取装置，美国Supelco公司;SPME萃取头(50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Stableflex 2cm);气质联用仪，美国Agilent公司(7890A，5975C);氨基酸分析仪L-8900，日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 中国虾头蛋白水解产物的制备

1.2.1.1 样品前处理方法

将中国对虾虾头清洗干净，经冷冻干燥后绞碎，即为虾头冻干粉，抽真空密封后于0℃保存待用。

1.2.1.2 水解液的制备

准确称取样品按水料质量比4∶1加水后，加入底物质量2.5%的蛋白酶。调节体系初始pH到各蛋白酶的最适 pH(Flavorzyme pH 6.5，Papain pH 6.5，Alkaline protease pH 8.0，Neutral protease pH 6.5，Protamex pH 6.0)，置于各蛋白酶最适温度下酶解，于80℃灭酶5 min，5 000 r/min离心10 min后取上清液定容即得。

1.2.1.3 虾头蛋白水解度的测定

(1)总氮的测定:自动凯氏定氮法，经3次测定求平均值，求得总氮含量(X0)。

(2)氨基态氮的测定:甲醛电位滴定法［4］。

(3)水解度的计算:DH/%=X/X0×100。X为酶解液中氨基氮质量;X0为样品中总氮质量。

1.2.1.4 多肽含量的测定［6］

双缩脲试剂:A液，0.1 g/mL NaOH溶液;B液，0.01 g/mL CuSO4溶液。取2.5 mL经1倍稀释的水解液，加2.5 mL 10%的三氯乙酸混匀，静置10 min，在5 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL测定，加4 mL 0.1g/mL NaOH溶液混匀后，加3 mL CuSO4混匀，室温静置30 min，于540 nm处比色，并用蒸馏水做对照。

1.2.2 游离氨基酸含量测定

将待测样品经等体积的10%磺基水杨酸溶液沉淀蛋白后，14 000 r/min离心15 min，稀释到适当浓度后，再用0.22 μm水系滤膜过滤，通过L-8900氨基酸分析仪分析其氨基酸含量。

1.2.3 虾头蛋白水解液MPRs的制备

称取5%的木糖于水解4 h的各蛋白酶水解液中并搅拌均匀，用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L的醋酸溶液调节pH至7.8，封口，于115℃的油浴锅中反应20 min后取出，迅速于冰浴中冷却备用。

1.2.4 虾头蛋白水解液MPRs挥发性成分测定

在20 mL的样品瓶中装入5 mL虾头蛋白水解液MPRs，将顶空瓶放入50℃恒温水浴中平衡20 min，再将已老化好的SPME针头插入样品瓶中，用手柄将石英纤维头暴露到顶空气体中萃取30 min后，用手柄使纤维头推回到针头内;拔出针头，将吸附了分析组分的萃取头插入GC-MS进样器中，使待测组分解吸，进入GC-MS进行分离与分析。

1.2.5 气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析

1.2.5.1 气相色谱条件

柱子型号:VF-5 ms，30m ×0.25 mm ×0.25 μm;柱温:初始温度40℃ 4 min，升温速率5℃/min，终温240℃ 5 min;进样口温度:250℃;柱流速:1.0 mL/min;载气:He(99.999%)。

1.2.5.2 质谱条件

扫描范围:采集的质量范围30～550 amu;传输温度:280℃;四级杆温度:220℃。

1.2.5.3 挥发性化合物的鉴定

根据GC-MS分析对虾头蛋白水解液MRPs中挥发性化合物鉴定，将分离出的化合物的质谱数据与经计算机检索标准谱图库相匹配。

1.2.5.4 挥发性化合物相对含量的确定

采用峰面积归一化法

1.2.6 感官评定

通过添加0.5%的NaCl评价MRPs的风味特征，同时以0.5%的NaCl溶液作为对照溶液，60℃恒温水浴恒温10 min，进行感官评定。打分采用7分制，将0.5%的NaCl溶液设定为3分，分值越大表明作用效果越强。感官评定小组由6位感官经验较丰富的评定人员(3男3女)分别对各感官指标(鲜味、醇厚味、持续感和焦甜味)进行评分。

2 结果与讨论

2.1 虾头蛋白水解过程中蛋白水解度变化

由图1可以看出，随着水解时间的延长，5种蛋白酶对中国对虾虾头蛋白的水解度都呈逐渐升高的趋势，但每种蛋白酶对虾头蛋白的水解能力各不相同。其中Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease在水解虾头蛋白过程中的水解度相对较高，Protamex虽然在初期的水解度很低，但3 h后水解度有较大提高，Papain对虾头蛋白水解能力较差，不适合虾头蛋白的水解。

图1 虾头蛋白水解过程中水解度变化Fig.1 Change of hydrolysis degrees during the hydrolysis of shrimp head protein

2.2 虾头蛋白水解过程中多肽含量变化

图2是不同蛋白酶水解虾头蛋白过程中多肽含量变化。由图2可知，5种蛋白酶水解液中多肽含量在水解过程中都呈现先升高后降低的趋势;李艳红［6］在利用排阻色谱法研究鹰嘴豆蛋白酶解物的过程中发现，随着水解程度的加深，酶解物的相对分子质量分布总体表现为大分子质量肽含量逐渐减少，小分子量肽含量逐渐增多，随后，小分子质量肽段被进一步水解成分子质量更小的肽段或氨基酸，因此，酶解物中多肽含量在水解后期有所下降。然而，不同蛋白酶水解虾头蛋白过程中多肽含量变化各有特点:Protamex和Papain水解液中多肽含量相对较高，而Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease水解液中多肽含量较低。结合图1和图2可知，Alkaline protease、Flavorzyme和Neutral protease对虾头蛋白的水解程度较大，但水解液以氨基酸为主，多肽含量较低;Papain水解液中多肽含量虽然较高，但其对虾头蛋白的水解程度较弱;与以上4种蛋白酶相比，Protamex对虾头蛋白具有较好的水解能力，同时水解液中多肽含量相对较高。

图2 虾头蛋白水解过程中多肽含量变化Fig.2 Change of peptide contents during the hydrolysis of shrimp head protein

2.3 虾头蛋白水解液Maillard反应前后氨基酸组成变化

表1是虾头蛋白水解液Maillard反应前后氨基酸组成变化分析结果。其中Alkaline protease水解液中氨基酸总含量最高，其次是Neutral protease、Protamex和Flavorzyme水解液，而Papain水解液中氨基酸总含量最低。5种蛋白酶水解液中氨基酸总含量在Maillard反应后均有所降低，消耗量最大的氨基酸主要有半胱氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。图3是不同蛋白酶水解液Maillard反应过程中鲜味氨基酸和含硫氨基酸的消耗量;Protamex水解液中鲜味氨基酸的总消耗量为负值，说明Maillard反应过程中由多肽降解产生的鲜味氨基酸与原有鲜味氨基酸的总含量大于反应过程中消耗的鲜味氨基酸含量，这对MRPs的鲜味贡献作用较大;而其他4种蛋白酶水解液中鲜味氨基酸消耗量主要为正值。据文献报道［7］，含硫氨基酸的消耗对MRPs的肉香香气贡献较大;由图3也可看出，5种蛋白酶水解液中含硫氨基酸的消耗量都为正值，这说明Maillard反应促使水解液中的含硫氨基酸生成呈香物质。总的来看，各水解液中必需氨基酸含量变化不大。

表1 蛋白酶水解液及其MRPs中氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of protein hydrolysates and their MRPs

2.4 不同蛋白酶水解液MRPs挥发性成分分析

由图4可以看出，Protamex水解液MRPs中检测出的含氮杂环化合物、含硫化合物和含氧杂环化合物的含量都较高，其中含氮杂环化合物2，5-二甲基吡嗪相对含量达到5.58%(见表2)，该化合物具有烤香味和坚果香味［8－9］，含硫化合物二甲基二硫和二甲基三硫的相对含量分别为5.63%和3.21%(见表2)，这两种化合物通常具有特征的烤肉香气、坚果气味及洋葱气味，对虾香味和肉香味具有重要贡献［2，10］;Alkaline protease 水解液 MRPs中含氮杂环化合物和含硫化合物含量也较高，其中检测出的2-甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、二甲基二硫和二甲基三硫的含量分别为2.50%、6.38%、4.52%和2.35%(见表2)，使其Maillard产物具有较强的烤肉特征风味;对于Neutral protease来说，其MRPs中含氮杂环化合物与酮类化合物含量较高，检测出的2，3-辛二酮具有奶香味和果甜香味，常用于做焙烤香精［11］;同时检测出的2，5-二甲基吡嗪和嘧啶使其烧烤的特征风味明显;而Papain和Flavorzyme水解液MRPs中检测出的含氮、氧杂环化合物、含硫化合物和酮类化合物的含量都相对较低，其特征风味较不明显。由此可以看出，酶的种类不同，其各自的MRPs挥发性特征成分具有较大差异，这与水解产物中氨基酸与多肽的组成与含量有较大关系;据相关文献报道，蛋白水解液MPRs挥发性成分的形成主要取决于水解液中氨基酸组成、多肽分子质量分布及肽的构成方式等［12］，分子质量在1 000～5 000 Da的多肽在美拉德反应过程中会产生较强的肉香味［13］，随着游离氨基酸和小分子质量寡肽的增多，美拉德反应后生成的吡嗪类风味物质增多，醛类物质的种类减少［14］;而蛋白酶的种类是影响蛋白水解液中多肽结构和氨基酸组成不同的主要因素之一。

图4 不同蛋白水解液MRPs中特征风味化合物Fig.4 Characteristic flavor compounds of MRPs derived from different protein hydrolysates

2.5 不同蛋白酶水解液MRPs的感官评价

图5为5种蛋白酶水解液MRPs的感官评定结果。5种MRPs主要呈鲜味、醇厚味和焦甜味，持续感较强，酸味和苦味较淡。其中，焦甜味、酸味和苦味差别不大;FM鲜味稍强，但持续感和醇厚味较差;PaM持续感和醇厚味一般，但鲜味较差;NM无论是鲜味、持续感还是醇厚味都相对较差;AM具有较强的鲜味，但其持续感和醇厚味相对较差;PrM的鲜味、持续感和醇厚味都相对较强。Protamex水解液在Maillard反应过程中，其鲜味氨基酸含量增加(见图4)，因此，其PrM在感官评定中呈现较强的鲜味;而鲜味、持续感和醇厚味可归因于水解液中的呈鲜味或有鲜味增强作用的小肽类物质，这些肽类物质在发生美拉德反应后可使体系中的鲜味、持续感和醇厚味明显增强［15］。

图5 不同蛋白水解液MRPs感官评定Fig.5 Sensory evaluation of MRPs derived from different protein hydrolysates

3 结论

(1)随着水解时间的延长，5种蛋白酶对中国对虾虾头蛋白的水解程度逐渐加深，氨基酸含量逐渐增大，多肽含量先升高后降低。其各自水解产物经美拉德反应后，游离氨基酸含量普遍降低，MRPs挥发性特征成分具有较大差异，其感官滋味强弱不同，主要呈鲜味、醇厚味和焦甜味，持续感较强，酸味和苦味较淡。

(2)Protamex水解液中多肽和游离氨基酸含量都相对较高，其MRPs具有较强的肉香味、海鲜味和烤肉香味等特征风味，鲜味氨基酸含量有所升高，其鲜味、持续感和醇厚味等感官滋味都相对较强。因此，复合蛋白酶比较适合对虾头蛋白水解，并通过Maillard反应进一步制备鲜味肽或鲜味增强肽。

表2 不同蛋白水解液MRPs的挥发性化合物Table 2 Volatile compounds of MRPs derived from different protein hydrolysates

［1］ 韩晓祥，郭小旬，励建荣.中国对虾调味料风味前提物质酶解制备工艺研究［J］.中国食品学报，2012，12(4):100－106.

［2］ 张连富，隋伟.固相微萃取虾味香精中风味化合物的研究［J］.食品科学，2007，28(5):264－267.

［3］ 刘安军，魏灵娜，曹东旭，等.美拉德反应制备烧烤型虾味香精及气质联用分析［J］.现代食品科技，2009，25(6):674 －677，680.

［4］ 赵梅.罗非鱼下脚料酶解工艺的研究［D］.福州:福建农林大学，2007.

［5］ 李高扬.蚕蛹抗氧化多肽的制备及分离纯化研究［D］.广州:华南理工大学，2011.

［6］ 李艳红.鹰嘴豆蛋白酶解物的制备及其抗氧化肽的研究［D］.无锡:江南大学，2008.

［7］ Shahidi F.肉制品与水产品的风味［M］.北京:中国轻工业出版社，2001:5－12;278－291.

［8］ Sang Eon Lee，Hyun Chung，Young-Suk Kim.Effects of enzymatic modification of wheat protein on the formation of pyrazines and other volatile components in the Maillard reaction［J］.Food Chemistry，2012，131(4):1 248 －1 254.

［9］ YU Ai-Nong，ZHANG Ai-Dong.Aroma compounds generated from thermal reaction ofL-ascorbic acid withL-cysteine［J］.Food Chemistry，2010，121(4):1 060 －1 065.

［10］ Machiels D，Van Ruth S M，PosthumusM A，et al.Posthumus.Gas chromatography-olfactometry analysis of the volatile compounds of two commercial Irish beef meats［J］.Talanta，2003，60(4):755 －764.

［11］ 洪伟，何锡敏.奶香型香料2，3-辛二酮的合成［J］.香料香精化妆品，2007(1):1－3.

［12］ Zhang Y，Dorjpalam B，Ho C T.Contribution of peptides to volatile formation in the Maillard reaction of casein hydrolysate with glucose［J］.Food Chemistry，1992，40(12):2 467－2 471.

［13］ Karangwa Eric，Linda V R，Meigui Huang，et al.Sensory attributes and antioxidant capacity of Maillard reaction products derived from xylose，cysteine and sunflower protein hydrolysate model system［J］.Food Research International，2013，54(2):1 437 －1 447.

［14］ 钟泓波，黄婵媛，尹文颖，等.不同分子量段小麦面筋蛋白酶解液对美拉德反应物风味的影响［J］.食品与发酵工业，2012，38(7):63 －67.

［15］ Ueda Y，Sakaguchi M，Hirayama K，et al.Characteristis flavor constituents in water extract of garlic［J］.Agriculural and Biological Chemistry，1990，54(1):163 －169.