应用高内涵分析技术进行药物肝毒性风险评估的研究

高　阳，胡宇驰，左泽平，王志斌，金家金，王立娜，程　源

（1.中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京市保健食品化妆品检验中心，北京市药品检验所，北京　100035；2.北京中医药大学，北京　100102）

·实验研究·

应用高内涵分析技术进行药物肝毒性风险评估的研究

高阳1，胡宇驰1，左泽平1，王志斌1，金家金2，王立娜2，程源2

（1.中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京市保健食品化妆品检验中心，北京市药品检验所，北京100035；2.北京中医药大学，北京100102）

目的研究尝试应用高内涵分析技术建立药物肝毒性高内涵毒性评价指数测定的标准方法。方法采用ToxInsight药物肝毒性检测试剂盒，利用对多靶点的特异性染色，结合高内涵活细胞成像分析平台考察4种药物对人源性肝癌细胞HepG2的细胞毒性作用，包括对该细胞的细胞数、核DNA含量、细胞质内谷胱甘肽降低水平、活性氧水平、线粒体膜电位的改变等5个指标进行综合分析，拟对受试样品的肝毒性进行评估。结果氟西汀和罗格列酮的肝毒性评估结果为阴性；甲芬那酸和噻氯匹定的肝毒性评估结果为阳性，提示具有肝毒性风险，且甲芬那酸的肝毒性风险比噻氯匹定的高。结论应用高内涵分析技术评估药物肝毒性的方法基于活细胞、多参数、实时、高通量，能够实现药物多种生物活性、毒性的早期、快速检测，并且灵敏稳定，简便可行，可尝试用于对药物进行体外肝毒性的安全风险评估。

高内涵分析；药物肝毒性；毒性评估

高内涵分析技术（High content analysis，HCA）是一种基于细胞表型分析的高效筛选技术，能够在保持细胞结构和功能完整的前提下，同时检测待测样品对细胞形态、生长、周期、迁移、凋亡、代谢途径及信号传导等方面的影响，从单一试验中获取大量有关信息，从而确定化合物的生物活性以及潜在毒性［1，2］。

药物肝毒性的评价在新药研发及药物安全风险评估中占重要地位。目前HCA能够实时监测体外肝细胞与毒性机制相关的多个重要标志分子，包括细胞核的形态和数量、线粒体膜电位以及氧化应激状态、凋亡与早期DNA损伤的变化等，是体外评价化合物潜在肝毒性和从机制上预测候选药物安全性的高效手段。该方法能够弥补动物实验灵敏度低、周期长、不能量化的缺点，因此，HCA已成为药品质量风险与安全风险评估的新技术趋势［3～5］。

本试验采用 ToxInsight药物肝毒性试剂盒，利用对多靶点的特异性染色，结合高内涵活细胞成像分析平台考察4种药物对人源性肝癌细胞HepG2的细胞毒性作用，包括对该细胞的细胞数、核DNA含量、细胞质内谷胱甘肽（GSH）降低水平、细胞内活性氧（ROS）水平、线粒体膜电位（MMP）的改变等5个指标进行综合分析，拟对受试样品的肝毒性进行评估。尝试建立药物肝毒性高内涵毒性评价指数测定的标准方法，以期实现利用HCA对药物进行体外肝毒性的安全风险评估。

1　材料与方法

1.1细胞人肝癌细胞系HepG2细胞，购自中国细胞库（上海），本实验室细胞库保存；细胞用DMEM完全培养基［含15％的胎牛血清（FBS，V/ V），100 U·mL-1的青链霉素］培养。培养条件为37℃，5％CO2。

1.2药物和对照品氟西汀（批号：WXBB5990V）、罗格列酮（批号：034M4736V）、噻氯匹定（批号：101296953）、甲芬那酸（批号：MKBR7799V）均购于Sigma公司。阴性对照品阿司匹林（批号：00209，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.3主要仪器与试剂体外毒性分析平台（美国Thermo Scientific Cellomics），该系统主要组成部分是：荧光显微系统、自动化荧光图像获取系统、检测仪器、图像处理分析软件、结果分析和数据管理系统等；Vortex Genie-2型涡流振荡器；超净工作台；倒置显微镜；台式离心机；电子天平；Napco Model 5410型CO2培养箱；全自动细胞计数仪。

高内涵肝毒性试剂盒（批号：0k192906，Thermo Scientific Cellomics）；Ⅰ型胶原蛋白包被的96孔细胞培养板（批号：354407，BD公司）；DMEM培养基（批号：1294154，Gibco公司）；标准胎牛血清（批号：20130726，天津市灏洋生物制品科技有限公司）；青链霉素（批号：1308300，Gibco公司）；胰蛋白酶（批号：2035B358-0458，Amresco公司）；PBS（NaCl 8 g·L-1，KCl 0.2g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3.4g·L-1，KH2PO40.2g·L-1，pH 7.2）；二甲基亚砜（DMSO）（批号：2035B358-0231，Amresco公司）等。

1.4HepG2细胞准备HepG2细胞复苏传代生长至70％～90％后，弃去培养瓶内培养基，PBS清洗2 ～3次，0.25％胰蛋白酶覆盖细胞约30 s后吸去胰酶，37℃放置2～3 min，加入含15％FBS的 DMEM完全培养基终止消化并吹打细胞，制备细胞混悬液并计数。完全培养基调整细胞浓度至2.0× 105·mL-1。将调整好密度的细胞液接种到Collagen-Ⅰ包被的96孔细胞培养板中，每孔100 μL（即20 000个/孔）。将培养板置37℃，5％CO2培养箱中培养16～24 h。

1.5样品配制无菌条件下配制。阴性对照品和各样品均以200×Cmax（最大血药浓度）为最高剂量，在无菌EP管内用无血清DMEM培养基依次向下倍比稀释7个浓度，振荡混匀备用。终浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.6Cmax。阴性对照品阿司匹林的Cmax为0.995 μg·mL-1；各样品Cmax分别为：氟西汀0.015 μg·mL-1、罗格列酮0.373 μg·mL-1、噻氯匹定2.13μg·mL-1、甲芬那酸6.5μg·mL-1（药物肝毒性试剂盒说明书提供）。

1.6加样操作无菌条件下操作，依次将各样品和阴性对照品加入培养板孔内，每个浓度重复3孔，每块培养板设溶媒对照（即无血清培养基）24孔，每孔100 μL。将加样后培养板置37℃，5％CO2培养箱中继续培养24 h。

1.7染色测试当天，按药物肝毒性试剂盒说明书配制Monochlorobimane（mBCl）染色液、ROS染色液、Hoechst 33342及Mito染色液。小心吸去培养板内的液体，加入配制好的染液，每孔100 μL。培养板置37℃，5％CO2培养箱中孵育45 min。将板孔内液体小心吸去，用放置至室温的PBS溶液清洗1遍，再在每孔中加入100 μL PBS，待测。

1.8肝毒性检测采用高内涵分析平台的DILIAcqonly模块采集图像。采集条件如下：第一通道波长为360 nm/460 nm检测Hoechst 33342标记的细胞核DNA并记录细胞数，第二通道波长为380 nm/ 461 nm检测mBCl标记的GSH，第三通道波长为504 nm/529 nm检测 ROS Dye标记的ROS，第四通道波长为584 nm/606 nm检测Mito Dye标记的线粒体膜电位；选择20倍物镜，每孔采集9个视野的图像，存储信息用于图像分析。

1.9肝毒性分析采用DILI-HepG2-HELLY分析软件对细胞核数量、核面积、核DNA、谷胱甘肽（GSH）、过氧化物（ROS）、线粒体膜电位（MMP）进行定位和定量分析，并以细胞数量、核DNA含量、GSH水平、ROS水平和MMP改变参数形式表示。最终数据在Excel工作表的DILI模块中计算汇总，以统计学方式将多个单参数结果汇总成称为“毒性指标”的多参数计算值，比较不同样品之间和不同剂量之间的毒性风险。

2　结果

2.1对HepG2细胞凋亡的影响试验结果显示，不同浓度的4种药物与HepG2细胞分别作用24 h后，甲芬那酸和噻氯匹定对细胞存活有明显的抑制作用，能明显抑制HepG2细胞的增值。而氟西汀和罗格列酮与阴性对照（阿司匹林）相比，细胞数量无显著差异。Hoechst 33342染色结果表明，阴性对照的细胞核呈均匀的荧光（E），而甲芬那酸和噻氯匹定分别作用24 h后，随药物浓度的增加，出现不同程度的细胞核皱缩，染色质凝集，细胞数量明显减少，显示细胞凋亡的特征。如图1所示。

图1　4种药物对HepG2细胞的细胞状态和荧光强度的比较结果（200×Cmax）

2.2对HepG2细胞GSH和ROS的影响如图2所示，甲芬那酸随剂量的增加，GSH水平基本呈现下降趋势，同时，ROS水平则呈上升趋势。200× Cmax浓度时，GSH水平降至阴性对照的阈值以下，显示出毒性预警。而氟西汀各剂量组的GSH和ROS均在阴性对照的安全阈值以内，提示无毒性风险。

2.3对HepG2细胞线粒体膜电位的影响高内涵荧光成像系统结果显示，阴性对照的细胞膜电位最高，呈现紫红色荧光，荧光强度较强。甲芬那酸和噻氯匹定细胞红色荧光逐渐减弱。随浓度的增加，对应的红色荧光强度的细胞群比例有所下降，且荧光强度降低。甲芬那酸随浓度的增加，线粒体膜电位的水平显著降低，超出阴性对照的安全阈值的下限范围，提示具有毒性风险。如图2、3所示。

2.4肝毒性风险评估DILI-HepG2-HELLY分析软件对细胞数量、核DNA含量、GSH水平、ROS水平和MMP改变5项参数汇总，以统计学方式将多个单参数结果汇总成“毒性指标”的多参数总结果，氟西汀和罗格列酮5项检测指标均为阴性，提示无肝毒性风险。噻氯匹定细胞数量、GSH水平和MMP改变3项检测指标为阳性，甲芬那酸5项检测指标也均为阳性，提示噻氯匹定和甲芬那酸具有肝毒性风险，且甲芬那酸的毒性风险比噻氯匹定的高，具有更高的毒性预警，结果见表1。

表1　4种目标药物肝毒性分析结果（DILI分析模块）

3　讨论

以阴性对照（阿司匹林）确定毒性阈值（细胞增值不认为是一种毒性反应，不设上限；低水平的ROS不认为是一种毒性反应，不设下限），分析各个靶点上的毒性反应，运用多个参数进行肝毒性预测及等级排序。药物的毒性反应是根据所有浓度下各个靶点的毒性结果的综合评价。通过对5个测量靶点的观察，若有一个靶点的任何一个浓度反应超过毒性阈值，则确定该药物有毒性，从而解决没有直接量效曲线的问题。本试验中，氟西汀和罗格列酮结果为阴性，提示在试验剂量下无肝毒性风险。高剂量的甲芬那酸和噻氯匹定能显著抑制HepG2细胞的增值，诱导其凋亡，检测结果为阳性，表现出一定的肝毒性风险，且甲芬那酸的毒性风险比噻氯匹定的高。试验结果与美国Thermo公司提供的国外试验数据结果基本一致。该方法基于活细胞、多参数、实时、高通量，能够实现药物多种生物活性、毒性的早期、快速检测，并且灵敏稳定，简便可行，可尝试用于对药物进行体外肝毒性的安全风险评估［6］。

图2　甲芬那酸（1）和氟西汀（2）抑制HepG2细胞增殖，对HepG2细胞数、DNA损伤、GSH水平、ROS水平和MMP变化的影响（量效曲线）

试验表明，药物HCA不但可以阐明被筛样品与药靶之间的相互作用关系，而且还能同时了解细胞的其它生物学改变，通过观察细胞形态来预测化合物的毒性以及进行相关代谢途径的研究，弥补了现有毒理学筛选方法在通量、毒性机制检测、潜在毒性揭示等方面的不足，是毒理学新兴和最具效率的技术［7，8］。常规的细胞毒性检测内容包括膜完整性的丧失或细胞溶解、凋亡、关键大分子损耗、代谢抑制效应和增殖抑制效应等。这些检测可以初步观察化合物毒性特点。然而，不同的方法分开进行，既耗时且难以获得一致的试验数据。HCA用于细胞毒性测定，在一次试验中平行监测与毒性机制相关的多个参数甚至是信号转导分子，更能全面准确地反映化合物诱导的毒性特征及潜在机制［9，10］。

［1］Zock JM.Applications of high content screening in life science research［J］.Comb Chem High Throughput Screen，2009，12（9）：870-876.

［2］Taylor DL，Haskins JR，Giuliano KA.Methods in Molecular Biology：Vol.356.High Content Screening：A Powerful Approach to Systems Cell Biology and Drug Discovery ［M］.Totowa：Humana，2007：83-94.

［3］Dragunow M.High-content analysis in neuroscience ［J］.Nat Rev Neurosci，2008，9（10）：779-788.

［4］Edwards BS，Oprea T，Prossnitz ER，et al.Flow cytometry for high-throughput，high-content screening［J］.Curr Opin Chem Biol，2004，8（4）：392-398.

［5］赵金伴，喻希.化学技术的前沿——高内涵筛选技术的研究及应用［J］.化工技术与开发，2008，37（8）：19-22.

［6］O′Brien PJ，Irwin W，Diaz D，et al.High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening［J］.Arch Toxicol，2006，80（9）：580-604.

［7］Lang P，Yeow K，Nicholsa A，et al.Cellular imaging in drug discovery［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（4）：343-356.

［8］Freeley M，Bakos G，Davies A，et al.A high-content analysis toolbox permits dissection of diverse signaling pathways for T lymphocyte polarization［J］.J Biomol Screen，2010，15（5）：541-555.

［9］胡经阳，严春琳，朱彦，等.高内涵筛选应用于中药现代化的前景展望［J］.天津中医药大学学报，2013，32（2）：120-124.

［10］刘利波，王莉莉.高内涵分析在新药发现毒理学中的应用进展［J］.中国药理学与毒理学杂志，2012，26（6）：893-896.

Study on the risk assessment of drug hepatoxicty by high content analysis

GAO Yang1，HU Yu-chi1，ZUO Ze-ping1，WANG Zhi-bin1，JIN Jia-jin2，WANG Li-na2，CHENG Yuan2（1.Beijing Key Laboratory of Analysis and Biological Evaluation of Traditional Chinese Medicine
Composition，Beijing Center for Health Food and Cosmetics Control，Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100035，China；2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To study a standard method for the determination of drug hepatoxicty evaluation index using high content analysis.Methods To investigate the cytotoxic effect of four drugs on HepG2cells in human hepatocellular carcinoma cells by using ToxInsight Drug Induced Liver Injury Assay Cartridge and combining high content live cell imaging analysis platform.Through the comprehensive analysis of 5 indexes，the number of cells，DNA content，GSH level，ROS level and mitochondrial membrane potential，the liver toxicity of the tested samples were evaluated.Results The results of fluoxetine and rosiglitazone were negative.The results of mefenamic acid and ticlopidine were positive，which indicated that the risk of liver toxicity was high，and the risk of liver toxicity of mefenamic acid was higher than that of ticlopidine.Conclusion HCA was based on living cells，multi parameters，real-time and high content，can achieve a variety of biological activity，drug toxicity of the early and rapid detection.It was sensitive，stable，simple and feasible.HCA can be used to evaluate the risk of drug hepatoxicty in vitro.

High content analysis；Drug induced liver injury；Assessment of toxicity

R965

A

2095-5375（2015）12-0688-005

2013年北京市科技计划项目（No.Z131100005613032）

高阳，女，研究方向：药物药理学与毒理学研究，E-mail：gaoyang527@yeah.net

胡宇驰，男，主管药师，研究方向：药物药理学与毒理学研究，Tel：010-83229474，E-mail：yuchihu@bidc.org.cn