鞣云实素对果糖溶液喂养大鼠血清中IAPP、GLP-1及INS的影响

张建博，陈　平，谢　雨，龚建瑜，范 源

（1.云南中医学院中药学院，云南　昆明　650500；2.云南中医学院基础医学院，云南　昆明　650500；3.云南中医学院临床医学院，云南　昆明　650500）

鞣云实素对果糖溶液喂养大鼠血清中IAPP、GLP-1及INS的影响

张建博1，陈平1，谢雨2，龚建瑜1，范 源3

（1.云南中医学院中药学院，云南昆明650500；2.云南中医学院基础医学院，云南昆明650500；3.云南中医学院临床医学院，云南昆明650500）

目的果糖溶液喂养Wistar雄性大鼠，注射Wistar大鼠不同浓度的鞣云实素检测大鼠体内胰岛淀粉样多肽（IAPP）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及胰岛素（INS）浓度的变化。方法Wistar大鼠给予相同浓度果糖溶液连续灌胃3周，第4周腹腔注射不同浓度的鞣云实素溶液，隔1 d注射1次，连续注射3次，第7天取大鼠血清，利用酶标仪测定血清中胰岛淀粉样多肽、胰高血糖素样肽-1及胰岛素的浓度。结果果糖溶液喂养后胰岛素分泌减少、胰岛淀粉样多肽浓度降低、胰高血糖素样肽-1浓度升高；注射20 mg·kg-1鞣云实素溶液后胰岛素分泌增多、胰岛淀粉样多肽浓度明显降低、胰高血糖素样肽-1浓度明显增高；注射40 mg·kg-1鞣云实素溶液后胰岛素分泌与对照组相比明显减少、胰岛淀粉样多肽浓度明显增高且高于对照组、胰高血糖素样肽-1浓度明显降低。结论低浓度鞣云实素能够促进胰高血糖素样肽-1生成、刺激胰岛素分泌及抑制胰岛淀粉样多肽的形成，本实验为进一步研究鞣云实素对胰岛素抵抗大鼠模型的相关激素变化提供一定基础。

鞣云实素；Wistar大鼠；果糖；胰岛淀粉样多肽；胰岛素；胰高血糖素样肽-1

近年来，随着生活质量不断提高，饮食结构不断改变，果糖摄入过多的现象趋于普遍，代谢综合征的患病率也随之升高且趋于早龄化，已严重威胁人类的健康。近期研究表明，健康人群长期摄入过多果糖会产生胰岛素抵抗［1］，且胰岛素抵抗是代谢综合征的主要病因之一，此外，长期摄入果糖会导致胰岛β细胞凋亡率增加。Maiztegui等［2］在研究中，对成年Wistar大鼠用10％果糖溶液喂养3周，利用碘化丙啶染色法检测细胞凋亡，摄入果糖组与正常组相比胰岛β细胞凋亡率明显增加且有显著性差异，提示果糖可能具有诱导胰岛β细胞凋亡的作用。

鞣云实素又名柯里拉京（Corilagin.Cor），属于天然多酚类化合物，白色针形晶体粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机试剂，分子式为C27H22O18，分子量634.46，是余甘子、老鹤草、叶下珠、龙眼等药材的有效成分。鞣云实素具有保肝［3］、抑制病毒［4］、降血压［5］、抗炎［6］、抗肿瘤［7］、抗菌［8］、抗氧化［9］等多种生物活性。关于鞣云实素治疗糖尿病的相关报道较少，

目前国内外应用果糖溶液喂养大鼠的相关文献不多，果糖所致胰岛β细胞功能障碍与胰岛素（INS）、胰岛淀粉样多肽（IAPP）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）之间的关系需进一步明确。本实验观察鞣云实素对果糖溶液喂养后大鼠血清中INS、IAPP、GLP-1浓度的影响，为研究鞣云实素对果糖溶液喂养大鼠的药理活性提供一定实验基础。

1　材料与仪器

1.1实验材料 SPF级Wistar雄性大鼠（简阳达硕动物科技有限公司，动物合格证号：SCXKC11172013-24）；鞣云实素（南京泽朗医药科技有限公司）；果糖（华北制药华源有限公司）；饲料（昆明医科大学）；酶联免疫分析试剂盒96T（上海纪宁实业有限公司）。

1.2仪器离心机（Hitachi CF16RXII，日本日立）；352型酶标仪（Labsystems Multiskan MS，芬兰）；洗板机（AC8 Thermo Labsystems，芬兰）。

2　实验方法

2.1建立模型及分组给药取Wistar大鼠24只随机分成4组，即正常组、对照组、低浓度的鞣云实素组、高浓度的鞣云实素组，除正常组外其他3组均用20％浓度的果糖溶液喂养，喂养时间为3周。根据低浓度组大鼠腹腔注射20 mg·kg-1，高浓度组40 mg·kg-1，分别配制低浓度的鞣云实素溶液与高浓度的鞣云实素溶液：4 mg·mL-1与8 mg·mL-1，腹腔注射鞣云实素溶液5 mL·kg-1，注射间隔为1 d，第7天目内眦取血2 mL于离心管中，10 000 rpm离心10 min，取上清液作为测定硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）、IAPP、INS指标的待测物。

2.2酶联免疫分析测定INS、IAPP及GLP-1试剂盒严格按照说明书所指示在小试管中进行稀释。分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30 min。将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。再次培育，再次洗涤，每孔先加入50 μL显色剂A，再加入50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min。每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15 min以内进行。

2.3数据处理所有数据用SPSS 18.0统计软件进行分析，且用表示，组间比较采用ANOVA检验，P ＜0.05判定为差异具有统计学意义。

3　结果

喂果糖组（对照组）与正常组相比，INS呈下降趋势，注射20 mg·kg-1鞣云实素后与对照组相比，INS有一定的升高，当注射40 mg·kg-1鞣云实素后INS明显下降且比对照组INS浓度低，高浓度组与对照组相比具有差异性，对照组与正常组相比具有显著性差异（见图1）；与正常组相比喂果糖后IAPP有降低的趋势，注射20 mg·kg-1鞣云实素后与对照组相比IAPP浓度有明显的下降，当注射40 mg·kg-1鞣云实素时IAPP浓度有明显的增高，且比对照组浓度高，对照组与正常组相比具有差异性，与低浓度组及高浓度组相比具有显著性差异（见图2）；喂果糖组与正常组相比GLP-1浓度升高，注射20 mg·kg-1鞣云实素后与对照组相比GLP-1浓度明显升高，当注射40 mg·kg-1鞣云实素时GLP-1浓度急剧下降，且比对照组的浓度低，对照组与正常组相比具有差异性，对照组与低浓度组相比具有显著性差异（见图3）。表1为胰岛素抵抗指数，其中正常组与对照组相比、对照组与低浓度组及高浓度组相比，胰岛素抵抗指数没有统计学差异，表明没有产生胰岛素抵抗。

4　讨论

果糖在体内会代谢成游离脂肪酸和甘油三酯，长期高浓度游离脂肪酸可抑制胰岛素合成与分泌，加速胰岛β细胞凋亡。果糖通过抑制糖异生作用以及糖原分解作用可导致胰岛素抵抗以及代谢综合征的产生，影响胰岛β细胞功能。高果糖喂养大鼠诱导胰岛β细胞功能紊乱已被广泛地应用于建立胰岛素抵抗模型在糖尿病及其并发症的相关研究中。此外，果糖可诱导氧化应激对线粒体功能也有一定影响。Jaiswal等［10］在实验中发现，在大鼠L6骨骼肌细胞系中加入果糖会产生氧化应激，可导致骨骼肌线粒体功能障碍，产生胰岛素抵抗作用。

图1　酶联免疫分析INS的数据

表1　胰岛素抵抗指数

图2　酶联免疫分析IAPP的数据

图3　酶联免疫分析GLP-1的数据

IAPP主要存在于胰岛β细胞中，与胰岛素共同由胰岛β细胞合成与分泌，IAPP协同胰岛素可以精准的调节人体血糖。近期研究表明，IAPP具有一定的抑制胰岛素分泌的作用，Zhu等［11］在实验中，对Wistar大鼠胰腺中胰岛β细胞分离并培养，加入16.7mmol葡萄糖处理1 h后加入0.5、1.0、5.0、10.0 μmol的IAPP预处理30 min后对INS进行检测发现，IAPP的增多会减少胰岛素的分泌，且在5 μmol及10 μmol时有明显的差异性。GLP-1是一种主要由肠道L细胞分泌的激素，其具有刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的分泌、减少肝糖元输出、抑制食欲及摄食、减缓胃排空、改善外周组织对胰岛素的敏感性。近期研究发现，在健康人体内口服果糖后GLP-1浓度有明显的增高趋势［12］。此外，GLP-1类似物能够抑制IAPP前体的形成，从而减少IAPP的产生及积聚沉积［13］。

本实验结果提示，果糖喂养后可导致胰岛β细胞凋亡率有所增加，致使胰岛素分泌减少，此时大鼠血清中GLP-1的浓度略有升高，其可增加胰岛素敏感性、抑制IAPP的产生。腹腔注射20 mg·kg-1鞣云实素后与对照组相比，胰岛素分泌增加、GLP-1浓度明显增高、IAPP浓度明显降低，提示低浓度的鞣云实素可促进GLP-1生成的作用，刺激胰岛素的分泌，抑制IAPP的形成。当注射40 mg·kg-1鞣云实素后GLP-1的浓度明显降低且低于对照组，IAPP浓度有明显的增高且高于对照组的浓度，提示鞣云实素在高浓度时可能对胰岛β细胞产生毒性导致其凋亡，致使GLP-1浓度降低，促进IAPP形成，减少胰岛素的浓度。

本实验利用酶标免疫分析法测定果糖喂养大鼠腹腔注射鞣云实素对IAPP、GLP-1及INS的影响，发现低浓度的鞣云实素具有增加GLP-1的生成，促进胰岛素分泌，抑制IAPP的形成的作用；而高浓度的鞣云实素会增加IAPP的形成，减少GLP-1浓度且抑制胰岛素的分泌，提示：鞣云实素在低浓度（20 mg·kg-1）鞣云实素时可具有保护胰岛β细胞的作用，高浓度（40 mg·kg-1）可能对胰岛β细胞产生毒性，需进一步实验探究。本实验为探索鞣云实素对果糖溶液喂养大鼠的药理活性实验提供一定研究基础，为发现新的可治疗糖尿病的天然活性产物提供一定参考。

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The effect of corilagin for IAPP，GLP-1 and INS of rats which fed by fructose

ZHANG Jian-bo1，CHEN Ping1，XIE Yu2，GONG Jian-yu1，FAN Yuan3
（1.College of TCM，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China；2.College of Basic Medicine，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China；3.College of Clinical Medicine，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China）

Objective To feed male Wistar rats with fructose solution，and inject different concentration of corilagin solution to Wistar rats，determine the changes of the concentration of IAPP，GLP-1）and INS in rats serum.Methods To give same concentration of fructose solution to Wistar rats three weeks by intragastric administration.In the fourth week，different concentration of corilagin solution was admined by intraperitoneal injection，once every two days and three times.In the seventh day，blood serum of rats was collected and the concentrations of IAPP，GLP-1 and INS were determined by ELISA.Results After fed fructose solution，the rats secreted insulin was decreased，the concentration of IAPP was reduced and the concentration of GLP-1 was increased；After injected the concentration of 20 mg·kg-1corilagin，the insulin secretion was increased，the concentration of IAPP was decreased significantly，the concentration of GLP-1 was increased significantly；When injected the concentration of 40 mg·kg-1corilagin，the insulin secretion was decreased significantly to compared with control group，the concentration of IAPP was increased significantly and higher than control group，the concentration of GLP-1 was reduced significantly and lower than control group.Conclusion Corilagin at low concentration can promote the generation of GLP-1，stimulate insulin secretion and inhibit the formation of IAPP.The experiment provided some basis on the further research of corilagin for the hormonal changes related to insulin resistance in rats model.

Corilagin；Wistar rat；Fructose；IAPP；INS；GLP-1

R965

A

2095-5375（2015）12-0699-004

张建博，男，研究方向：中药质量标准与控制，E-mail：284529046@qq.com

范源，男，博士研究生，副教授，硕士生导师，研究方向：天然产物活性及糖尿病研究，Tel：13708874680，E-mail：1647909799@qq.com