A20突变与弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理特征及预后的关系

庹樱篮 陈琴 杨文秀

·临床研究与应用·

A20突变与弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理特征及预后的关系

庹樱篮 陈琴 杨文秀

目的：检查弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）中肿瘤坏死因子诱导蛋白3基因（tumor necrosis factor，alpha-induced protein 3 gene，A20基因）突变情况，探讨其对DLBCL进展、预后及肿瘤耐药的影响。方法：收集104例DLBCL病例及其临床资料并随访部分病例，应用免疫组织化学染色检测肿瘤细胞中P-gP和Ki-67蛋白表达；聚合酶链反应扩增和DNA测序检测A20基因外显子3、6、7突变情况；分析A20基因与DLBCL临床病理特征及预后的关系。结果：104例DLBCL中，A20基因3号外显子存在错义突变，总突变率17.3%。其中第73位突变率在ABC-DLBCL与GCB-DLBCL病例之间差异具有统计学意义（18.5%vs.2.5%，P=0.010）；在临床分期晚和高IPI指数的DLBCL病例中，A20突变率明显高于相应的早临床分期和低IPI指数病例（P＜0.05）。在A20基因突变与未突变病例之间P-gP表达的差异有统计学意义（16/18 vs.52/86，P=0.021），Ki-67低表达与高表达病例之间差异有统计学意义（低表达/高表达：1/17 vs.26/60，P=0.030）；与未突变病例比较，A20基因突变的DLBCL病例复发率有增高的趋势（P=0.06），生存状况较差（P=0.016）。结论：DLBCL病例中A20基因的突变对DLBCL的临床病理特征及生存状况有一定影响，A20基因突变可能是DLBCL预后不良的相关因子。

淋巴瘤 A20 突变 预后

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是常见的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）类型，属于侵袭性的大细胞淋巴瘤，2008年的WHO淋巴造血组织肿瘤分类将其分为十几种亚型［1］。核因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）异常活化对DLBCL发生和演进的影响越来越受到重视。肿瘤坏死因子诱导蛋白3基因（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 gene，A20基因）位于染色体6q23.3（为侵袭性B细胞淋巴瘤缺失高发的区域），其编码的A20蛋白作为肿瘤抑制因子，可以负调节NF-κB通路的活化［2-3］。有学者在黏膜相关结外边缘区B细胞淋巴瘤（extra-nodal marginal zone B cell lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）中发现A20基因的缺失突变或缺失异常（18%～22%），在DLBCL中检出A20突变和甲基化等异常［2，4-5］。目前的研究认为NF-κB信号传导通路的持续活化是弥漫大B淋巴瘤的重要特征。由此推测DLBCL中A20的异常可能通过减少对NF-κB活化的抑制而影响DLBCL的发展和预后。本研究收集了一组DLBCL病例，检测A20基因突变情况、肿瘤细胞的增殖及多药耐药基因编码产物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gP）的表达情况，收集临床病理资料，探讨A20突变与DLBCL临床过程、预后及肿瘤耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集贵阳医学院附属医院病理科2005年1月至2013年6月期间诊断的部分原发于结内或结外的弥漫大B细胞淋巴瘤病例。按照2008年WHO淋巴造血组织肿瘤分类［1］，进行病例筛选，其中符合诊断标准、具有完整病理和临床资料的104例DLBCL被纳入研究。DLBCL的分型参考Hans标准分为2个亚型：GCB样（CD10+或CD10-/bcl-6+/MUM1-）和non-GCB样即ABC样（CD10-/ bcl-6+/MUM1+或CD10-/bcl-6-/MUM1+）。其中GCBDLBCL 39例，ABC-DLBCL 65例。

1.2 方法

1.2.1 苏木素伊红染色按照常用病理操作规范进行［6-7］。

1.2.2 免疫组织化学染色采用S-P三步法，并根据抗体要求进行枸橼酸盐高压热修复。一抗P-gP（迈新公司）为单克隆-即用型，单克隆抗体Ki-67（1:100）和免疫组化检测试剂盒均购自中杉公司。以0.01M PBS（pH=7.2～7.4）的PBS代替一抗作空白对照。

阳性结果判定：P-gP阳性信号定位于细胞浆和细胞膜，Ki-67阳性信号定位于细胞核。每张切片计数10个400倍视野，计数1 000个细胞中的阳性细胞数，取10个400倍视野的均值。Ki-67蛋白以肿瘤细胞表达百分率划分为2个等级，即＜40%（低表达）及≥40%（高表达）。P-gP蛋白以细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒的肿瘤细胞数＞20%为阳性。

1.2.3 A20基因突变检测石蜡包埋组织DNA提取及PCR扩增：3～8 μm厚石蜡切片置于EP管中，二甲苯脱蜡、无水乙醇清洗、蛋白酶K消化，用酚-氯仿法提取DNA，分光光度计测提取DNA的吸光度值（260/ 280的比值）。A20基因外显子3、6、7的PCR扩增引物序列：外显子3上游5'-TCTTCTCCTCCTTTCTGT CC-3，下游5'-GTACCCTATGCCCACCAT-3'（产物271 bp）；外显子6上游5'-CTTGTTTAGTAGAATACT GTTTTACTTATG-3，下游5'-GGTGGCTGAGGTTAA AGACA-3'（产物291 bp）；外显子7上游5'-CTGGTA GATGATTACTTTGAACTTG-3，下游5'-GGGCGTTTC ACATTTTACAT-3'（产物150 bp）；PCR循环参数：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，退火（温度依次为56℃、58℃、58℃）45 s，72℃延伸40 s，循环40次，总延伸72℃10 min。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳进行观察，PCR产物送上海生工基因公司进行双向测序，对有突变病例再进行了反向测序证实。

1.2.4 随访随访资料通过患者门诊复查、电话随访结合信函调查获得。以首次明确病理诊断为随访开始时间，2013年12月31日为随访结束时间。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行处理分析。组间比较，采用χ2检验，计量资料采用独立样本t检验，生存分析采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，生存曲线的比较采用对数秩检验（Log-rank test），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征

104例DLBCL病例被纳入研究。其中男性59例，女性45例，男女之比1.31:1，发病年龄24～87岁，中位年龄56岁；发生于结内64例，结外40例；临床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期20例，Ⅲ期15例，Ⅳ期30例；IPI指数0～2为65例，3～5为39例；有B症状38例，无B症状66例；LDH值109～245 U/L 70例，＞245 U/L有34例。

2.2 A20基因突变检测结果

104例DLBCL样本的A20基因外显子3、6、7的PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，均可见目的条带（图1）。

104例DLBCL中18例存在A20基因突变，总突变率为17.3%（18/104）。均为3号外显子的错义突变（表1，图2）。

2.3 A20基因3号外显子突变与DLBCL类型及临床病理特征的关系

检测到A20基因3个位点突变，在73碱基位点，ABC-DLBCL突变率为18.5%（12/65），GCB-DLBCL突变率为2.5%（1/39），差异具有统计学意义，即第3号外显子73位是A20基因的主要突变位点，为非随机突变。3号外显子208和131位点的突变可能是随机突变，两种淋巴瘤亚型之间差异无统计学意义（表2）。

A20基因突变在临床分期较早（Ⅰ期，Ⅱ期）与较晚（Ⅲ期，Ⅳ期）病例之间有统计学差异，IPI指数0～2组与3～5组病例之间A20突变亦有差异（表3，P均＜0.05）。2.4A20突变与P-gP和Ki-67表达的关系

DLBCL肿瘤细胞中不同程度地表达P-gP和Ki-67（图3A，B）。P-gP阳性表达率65.4%（68/104）；Ki-67阳性表达率27例＜40%，77例≥40%。DLBCL中A20基因突变在Ki-67低表达组（＜40%）与高表达组（≥40%）之间以及P-gP阳性与阴性表达组之间差异均有统计学意义（P＜0.05，表4）。

图1 A20基因3、6、7外显子PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Figure 1PCR products of exons 3，6，and 7 of A20 gene on agarose electropherogram

表1 A20基因错义突变类型Table 1Types of missense mutation of A20 gene

图2 A20基因第3外显子DNA序列Figure 2DNA sequence of exon 3 of A20 gene

表2 A20基因3号外显子突变与DLBCL类型的关系Table 2Correlation between the types of mutation in exon 3 of A20 and DLBCL

表3 A20基因突变与DLBCL临床病理特征的关系Table 3Correlation between the genetic mutation of A20 and clinicopathologic features of DLBCL

2.5 随访

104例弥漫大B细胞淋巴瘤中有随访结果者62例，获访率为59.6%。随访时间为1～123个月，中位随访时间为40个月。62例获访病例中，生存33例，死亡29例（ABC-DLBCL 20例、GCB-DLBCL 9例），复发34例，死亡的29例中23例死于肿瘤，4例死于化疗反应，2例死于其他疾病。62例进行肿物切除；肿物切除后治愈2例，47例接受化疗治疗，CHOP化疗方案37例，疗程1～6个；余病例治疗方案不祥。

DLBCL的复发与DLBCL类型和Ki-67有关，ABC-DLBCL及肿瘤细胞高增殖活性的DLBCL复发率高（P＜0.05）。DLBCL死亡病例与A20基因突变、Ki-67高表达、高IPI评分及B症状等关系密切（P＜0.05）。同时，根据62例DLBCL病例A20基因突变情况绘制生存曲线（图4），A20基因突变与未突变病例之间生存状况有明显差异（P=0.016）。此外，在62例随访病例中，A20突变13例，其中ABC-DLBCL 12例（死亡9例），GCB-DLBCL 1例（死亡1例）。根据40例ABC-DLBCL病例A20基因突变情况绘制生存曲线（图5）。经生存分析结果显示，A20突变是ABCDLBCL病例不良预后的独立因素（P＜0.05，表5）。

图3 DLBCL肿瘤组织中P-gp、Ki-67表达情况Figure 3Expression of P-gp and Ki-67 protein in DLBCL tissues

表4 DLBCL中A20基因突变与两种蛋白表达的关系Table 4Correlation of abnormality of A20 with expression of Ki-67 protein and P-gP

图4 A20基因突变与未突变病例的生存曲线比较（P=0.016）Figure 4Comparison of survival functions between the cases with and without A20 mutation（P=0.016）

图5 ABC-DLBCL病例A20基因突变与未突变病例的生存曲线（P= 0.024）Figure 5Comparison of survival functions between the cases with and without A20 mutation in DLBCL（P=0.024）

表5 DLBCL患者预后与临床病理特征的关系Table 5Correlation between the relapse and death of DLBCL and its clinicopathologic characteristics

3 讨论

DLBCL是一组异质性的侵袭性淋巴瘤，近年来发病率逐渐上升，目前欧美国家发病约占NHL的31%［8］，我国病例已占到NHL的45.8%［9］。不同DLBCL亚型临床过程和预后不尽一致，仅根据临床分期、肿瘤细胞增殖指数、国际预后指数（international prognosis index，IPI）等恶性肿瘤通用的预后预测因素不能满足对异质性的DLBCL临床过程、预后、化疗效果等预测的需要。肿瘤的遗传学和分子生物学改变影响肿瘤的预后已被广泛报道。因此，在诊断时识别出影响DLBCL临床过程和预后、化疗效果的关键因素，对预后估计和治疗方案选择非常必要，同时也是寻求DLBCL治疗新靶点的重要基础。

NF-κB持续性活化是肿瘤发生发展的一个重要因素。由于A20与NF-κB通路活化相关，故被看作是一个肿瘤抑制因子［2］。A20蛋白是一种新型的锌指蛋白，具有去泛素化酶功能［10］。在TNF作用下或者TNF-R1过表达时，A20蛋白与IKKγ相互作用，阻断IKKγ将上游信号传递给IKKα和IKKβ亚基，从而阻止NF-κB的活化［11］，通过影响凋亡蛋白酶的合成而抑制细胞凋亡。关于A20基因对淋巴瘤的影响，有研究［12］发现将野生型A20基因导入A20缺失的淋巴瘤细胞株SUDHL2、RC-K8、L-1236和KM-H2中可以显著减少NF-κB表达，并且可以促进细胞凋亡和抑制细胞的增殖；将野生型A20基因导入A20基因正常或无NF-κB构成性活化的细胞株，则不能发挥其相应的作用。这一结果提示了A20作为A20缺失肿瘤的靶向基因治疗的可行性。国外有研究报道［13］，在多种淋巴瘤中存在A20基因的缺失或者突变。

目前关于A20基因在淋巴瘤中的变化国外已有一些报道，而A20基因在DLBCL中变化的研究缺乏系统报道。有研究统计A20基因发生缺失或突变高频率位点在外显子3、6和7［14］。本研究通过PCR扩增和直接测序，检查了A20基因外显子3、6、7的DNA突变情况。结果发现DLBCL中A20基因的DNA错义突变率为17.3%，较Dong等［15］的研究报道中错义突变率（21%）略低。同时发现DLBCL中外显子3的第73位的碱基突变率达12.5%，而第208位和131位碱基突变率分别为2.8%和1.9%，第73位碱基突变应是非随机突变，后两种突变不除外随机突变的可能。统计分析还发现ABC-DLBCL与GCB-DLBCL病例之间A20总突变率差异无统计学意义（21.5%vs.10.2%），但就主要突变位点（第73位碱基）分析，上述两组病例之间差异有统计学意义。推测该突变损害A20基因的功能，最终可能影响DLBCL尤其是ABC-DLBCL的发生发展，这仍需要更进一步的研究证实。

IPI包含年龄、血清乳酸脱氢酶、行为状况评分、Ann Arbor分期、淋巴结结外受侵数目［16］。本研究临床病理特征分析发现，在晚临床分期和高IPI指数的DLBCL病例中A20基因突变较多见，此外，多药耐药基因（multi-drug resistance gene，mdr gene）是NF-κB的靶基因，A20突变的DLBCL中mdr编码的产物P-gP蛋白表达明显增多。A20基因突变病例与野生型病例相比，肿瘤细胞Ki-67表达明显增高，后者是肿瘤细胞增殖活性的标志［17］。可以推测A20基因异常可能通过NF-κB对相关靶基因的调节而影响肿瘤细胞的增殖活性。生存分析也发现，A20基因突变的DLBCL病例复发率较未突变的DLBCL病例有升高的趋势；单因素生存分析发现A20基因突变病例的生存状况明显差于未突变病例。结果表明，A20基因突变对DLBCL的临床过程、肿瘤耐药和预后有一定程度的影响。这可能与肿瘤中A20基因突变而失活，对NF-κB的负调节作用减弱有关，使NF-κB持续活化，从而上调了mdr等靶基因。这一信号通路中，NF-κB作用的下游靶基因有待于下一步深入研究。A20突变对A20蛋白表达的影响也值得研究。

总而言之，一部分DLBCL中存在A20基因突变，而且这一遗传学改变与DLBCL的发生发展和预后有关，对DLBCL的临床病理特征有一定的影响，可能是DLBCL不良预后的相关因素。

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（2015-08-15收稿）

（2015-09-30修回）

（编辑：郑莉）

Relationship of A20 mutation with clinicopathologic features and prognosis of diffuse large B cell lymphoma

Yinglan TUO，Qin CHEN，Wenxiu YANG

Department of Pathology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81160299）.

Wenxiu YANG；E-mail:ypq1964@163.com

Objective:To detect A20 mutation and to investigate its relationship with clinicopathologic features，prognosis，and resistance to therapy of diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）.Methods:A total of 104 cases with DLBCL and their clinical data were collected；follow-up was performed on a few of DLBCL patients.The expression of P-gP and Ki-67 protein was detected with immunohistochemical staining.The A20 gene mutation in exons 3，6，and 7 were examined by polymerase chain reaction and DNA sequencing. Finally，the correlation of genetic abnormality of A20 with clinicopathologic features was analyzed.Results:Missense mutation in exon 3 of A20 gene was identified in 18 of 104 patients（17.3%）.The A20 gene mutation at site 73 of exon 3 was greater in the cases with activated B cell-like-DLBCL than with germinal center B-cell-like-DLBCL（18.5%vs.2.5%，P=0.010）.In contrast to the advanced clinical stage and high International Prognostic Index（IPI）cases，the rate of A20 mutation was superior to the opposite（P＜0.05）.The expression for P-gP was higher in the cases with mutation than that of those with wild-type A20 gene（16/18 vs.52/86，P=0.021）.The difference in A20 mutation between the groups of low and high positive expression for Ki-67（1/17 vs.26/60，P=0.030）was significant. DLBCL with A20 mutation had an increasing recurrence tendency（P=0.06）and a worse survival（P=0.016）compared with those with wild-type A20 gene.Conclusion:The A20 mutation has a certain influence on the clinicopathologic characteristics and survival conditions of BLBCL patients.Probably，A20 mutation is a factor associated with a poor prognosis of DLBCL.

lymphoma，A20，mutation，prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.20.882

贵州医科大学附属医院病理科（贵阳市550004）

杨文秀ypq1964@163.com

庹樱篮专业方向为淋巴瘤基础研究与临床。

E-mail：1024028096@qq.com