糖肾方对2型糖尿病大鼠肝脏氧化应激水平及病理改变的影响

李忻，顾立刚，赵婷婷，杨鑫，张韫，张浩军，严美花，董晞，赵海玲，文玉敏，李平△

糖肾方对2型糖尿病大鼠肝脏氧化应激水平及病理改变的影响

李忻1，2，顾立刚1，赵婷婷2，杨鑫2，张韫2，张浩军2，严美花2，董晞2，赵海玲2，文玉敏2，李平2△

目的观察糖肾方对2型糖尿病大鼠肝脏氧化应激水平及病理改变的影响，并探讨其可能的机制。方法采用高脂饲料喂养和小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔内注射方法，建立2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝动物模型。将造模成功的大鼠随机分为正常组、模型组、糖肾方组和二甲双胍组，比较各组大鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（CHO）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，肝组织超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、维生素E（VE）、一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）水平，并在光镜下观察各组大鼠肝组织病理形态学改变。结果与模型组相比，二甲双胍组和糖肾方组大鼠表现状态较好，毛色较光泽，粪便成形；二甲双胍组和糖肾方组大鼠的肝脏质量和肝脏质量指数较模型组明显下降，2组大鼠血清ALT、AST、TG、CHO、LDL-C水平显著降低。与模型组相比，糖肾方组大鼠肝组织匀浆中SOD、CAT、VE水平明显升高，NO、NOS水平减低；二甲双胍组大鼠肝组织匀浆中SOD、CAT水平明显升高，NO、NOS水平减低。HE染色显示二甲双胍组和糖肾方组较模型组大鼠肝细胞脂肪变性明显减少，肝细胞排列基本规则。结论糖肾方可改善2型糖尿病大鼠肝功能，降低血脂水平，减轻肝脏脂质沉积，其作用机制可能与其清除脂质过氧化物，改善肝组织氧化应激水平有关。

糖肾方；糖尿病，2型；肝损伤；氧化性应激

糖尿病是一组由遗传以及环境因素相互作用导致的代谢性疾病，严重威胁人类的健康。糖尿病合并非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver dis⁃ease，NAFLD）是其并发症之一，发病率逐年增加，但发病机制尚未完全明确。有研究发现NAFLD患者的氧化应激水平高于正常人群，说明氧化应激与其病因和发病机制有着密切关系［1］。本课题组在进行中药干预糖尿病并发症的实验研究时发现糖尿病肾病大鼠存在肝损伤［2］。糖肾方由黄芪、生地、三七等药组成，具有益气养阴、活血化瘀的功效。中医理论认为肝与肾的关系密切，即“肝肾同源”。糖尿病症状的出现与肝肾功能失调关系较为密切，特别是并发糖尿病肾病和糖尿病肝损伤时，其发生与肝肾阴虚、瘀血阻络密切相关。糖肾方可以改善糖尿病肾病大鼠的肾损伤［3］，但对肝脏的保护作用还鲜见报道。本实验对糖尿病大鼠给予糖肾方治疗，通过观察其血脂水平以及肝脏氧化应激和肝脏病理学的变化，探讨糖肾方在降低糖尿病大鼠血脂和保护肝脏中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性Wistar大鼠47只，6周龄，体质量160～180 g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2010-0001。饲养于中日友好医院临床研究所动物室（SPF级）。

1.2药物与饲料糖肾方配方颗粒由黄芪、生地、三七、大黄等药物组成，江阴天江药业有限公司加工，4 g/袋，批号060632。盐酸二甲双胍片（格华止）：中美上海施贵宝制药有限公司，规格0.5 g/片，批号1205102。高脂饲料成分：38%脂肪，12%蛋白质，50%碳水化合物。

1.3主要试剂及仪器

1.3.1主要试剂超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、维生素E（vitamin E，VE）、一氧化氮（nitricoxide，NO）、一氧化氮合酶（NO synthetase，NOS）和三酰甘油（triglyceride，TG）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3.2实验仪器代谢笼（苏州市冯氏实验动物设备有限公司）；One Touch UltraII稳豪血糖仪（美国强生公司）；全自动生化分析仪（美国CD-1600）；滑走式切片机（日本SAKURA）；奥林巴斯BX-51显微镜，DP70图像采集系统（日本OLYMPUS）。

1.4模型建立及实验分组将大鼠适应性喂养3 d后，测量血糖、体质量，剔除指标异常的动物，将动物按随机数字表法分为正常组（n=12）和模型组（n=35）。正常组大鼠给予普通饲料，模型组大鼠给予高脂饲料，5周后，取正常组和模型组大鼠各4只，参照文献［4］进行胰岛素钳夹实验。模型组大鼠葡萄糖输注率显著低于正常组，表明模型大鼠出现了胰岛素抵抗，模型大鼠参照文献［5］以25 mg/kg体质量给予1%的链脲佐菌素（STZ）腹腔注射，72 h后测定空腹血糖，大于11.1 mmol/L视为造模成功。将成模动物35只按随机数字表法随机分成3组：模型组14只，二甲双胍组10只，糖肾方组11只。正常组和模型组均给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液；二甲双胍组给予500 mg/（kg·d）二甲双胍，混悬于0.5%羧甲基纤维素钠溶液；糖肾方组给予1.67 mg/（kg·d）糖肾方，混悬于0.5%羧甲基纤维素钠溶液。均是1次/d灌胃给药，10 mL/次，连续给药20周。

1.5检测指标

1.5.1一般情况密切观察大鼠精神状态、反应性、毛发色泽、饮食及排泄状况。每周称大鼠的体质量。实验结束，各组大鼠水合氯醛腹腔麻醉，取出肝脏后称其质量，计算肝脏质量指数=肝脏质量/体质量×100%。

1.5.2血生化指标自腹主动脉取血5 mL，离心取血清，用自动血生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶（aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、TG、总胆固醇（cholesterol，CHO）和低密度脂蛋白胆固醇（low den⁃sity lipoprotein-cholesterol，LDL-C）的含量。

1.5.3肝脏组织中肝组织SOD、CAT、VE、NO和NOS水平测定分离肝组织做成肝组织匀浆液，按试剂盒方法进行检测。

1.5.4肝脏组织学观察摘取大鼠肝脏右叶相同部位组织一块，冰生理盐水清洗后，10%福尔马林固定72 h后制备4 μm石蜡切片，用苏木素伊红染色。光镜下观察肝组织脂肪变性、炎症、坏死等病理变化。

1.6统计学方法应用SPSS 13.0统计软件处理，实验数据以表示。多组比较采用One-way ANOVA，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般情况正常组大鼠表现状态良好，正常饮食、饮水，毛色光泽，粪便成形；模型组大鼠进食量增加、饮水量增加、尿量增多，开始消瘦，毛色凌乱无光泽，活动减少。二甲双胍组和糖肾方组大鼠的状态较模型组均有改善。模型组、二甲双胍组、糖肾方组的体质量低于正常组，糖肾方组和二甲双胍组的肝脏质量和肝脏质量指数低于模型组，且糖肾方组高于二甲双胍组（P＜0.05），见表1。

Tab.1Comparison of body weights，liver mass and liver mass indexes between four groups表1 各组大鼠体质量、肝脏质量及肝脏质量指数比较

Tab.1Comparison of body weights，liver mass and liver mass indexes between four groups表1 各组大鼠体质量、肝脏质量及肝脏质量指数比较

＊＊P＜0.01；a与正常组比较，b与模型组比较，c与二甲双胍组比较，P＜0.05；表2、3同

组别正常组模型组二甲双胍组糖肾方组F n 12 14 10 11体质量（g）698.79±97.26 488.58±80.28a 478.12±93.85a 480.15±62.70a 7.379＊＊肝脏质量（g）14.96±2.60 23.91±4.29a 18.04±2.55ab 20.25±2.55abc 24.796＊＊肝脏质量指数（%）2.16±0.39 4.89±0.59a 3.72±0.48ab 4.22±0.42abc 76.335＊＊

2.2 糖肾方对血清学指标的影响ALT：模型组、二甲双胍组、糖肾方组高于正常组，二甲双胍组、糖肾方组低于模型组（P＜0.05）。AST、TG：模型组高于正常组、二甲双胍组、糖肾方组（P＜0.05），后3组无明显差异（P＞0.05）。CHO：模型组高于正常组、二甲双胍组、糖肾方组，糖肾方组高于正常组（P＜0.05）。LDL-C：模型组高于正常组、二甲双胍组、糖肾方组，糖肾方组高于正常组和二甲双胍组（P＜0.05），见表2。

Tab.2Comparison of serum markers between four groups表2 各组大鼠血清学指标比较

Tab.2Comparison of serum markers between four groups表2 各组大鼠血清学指标比较

组别正常组模型组二甲双胍组糖肾方组F n 12 14 10 11 ALT（IU/L）53.60±9.03 174.25±33.70a 93.52±35.11ab 121.77±41.68ab 17.713＊＊AST（IU/L）151.44±22.93 199.08±55.35a 127.70±28.84b 149.40±33.95b 10.603＊＊组别正常组模型组二甲双胍组糖肾方组F n 12 14 10 11 TG（mmol/L）0.42±0.27 1.17±0.53a 0.50±0.27b 0.60±0.29b 69.711＊＊CHO（mmol/L）2.15±0.32 4.61±2.37a 2.39±0.57b 2.82±0.71ab 48.287＊＊LDL-C（mmol/L）0.51±0.10 2.77±1.20a 0.70±0.31b 1.68±0.85abc 14.239＊＊

2.3肝脏组织学正常组大鼠肝脏组织结构清晰，肝索呈放射状分布，肝细胞形态规则，大小如常，无明显的脂肪变性和炎症。模型组大鼠肝小叶轮廓基本消失，肝细胞索模糊，肝窦变窄，胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴，存在炎性细胞浸润，部分肝细胞呈气球样变。糖肾方组和二甲双胍组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态规则，其脂肪变少见，炎症程度较模型组改善，见图1。

Fig.1HE staining of rat liver tissues in four groups（HE，×100）图1 糖肾方对2型糖尿病大鼠肝脏病理观察（HE，×100）

2.4对大鼠肝脏抗氧化能力的影响SOD：模型组低于正常组，二甲双胍组、糖肾方组高于模型组（P＜0.05）。CAT：模型组和糖肾方组低于正常组，二甲双胍组、糖肾方组高于模型组（P＜0.05）。VE：模型组和二甲双胍组低于正常组，二甲双胍组低于模型组，糖肾方组高于模型组和二甲双胍组（P＜0.05）。NO：模型组高于正常组，二甲双胍组、糖肾方组低于模型组，糖肾方组高于二甲双胍组（P＜0.05）。NOS：模型组、二甲双胍组和糖肾方组均高于正常组，二甲双胍组、糖肾方组低于模型组，糖肾方组高于二甲双胍组（P＜0.05），见表3。

Tab.3Comparison of oxidative stress indicators in liver tissues between four groups表3 各组大鼠肝脏氧化应激指标比较

Tab.3Comparison of oxidative stress indicators in liver tissues between four groups表3 各组大鼠肝脏氧化应激指标比较

组别正常组模型组二甲双胍组糖肾方组F n 12 14 10 11 SOD（U/mgprot）252.12±22.20 213.49±29.09a 246.43±14.10b 241.24±17.30b 5.938＊＊CAT（U/mgprot）10.97±2.39 6.82±1.54a 9.02±2.34b 8.34±0.69ab 7.723＊＊组别正常组模型组二甲双胍组糖肾方组F n 12 14 10 11 VE（μg/g）13.16±1.81 10.61±2.83a 8.40±0.73ab 14.13±0.68bc 8.670＊＊NO（μmol/gprot）0.13±0.04 0.27±0.15a 0.08±0.03ab 0.12±0.03bc 57.690＊＊NOS（U/mgprot）0.72±0.05 1.52±0.20a 1.08±0.13ab 1.32±0.15abc 16.629＊＊

3 讨论

糖尿病会导致各种并发症，几乎影响身体各处器官。NAFLD是糖尿病的主要并发症之一，长期糖尿病导致视网膜血管、肾脏、肝脏和神经系统并发症，包括其结构和功能改变。氧化应激是糖尿病并发症发展的影响因素，源于糖脂代谢紊乱引起的自由基生成增加和内源性抗氧化剂的减少。因此，改善糖尿病合并NAFLD需要关注抗氧化剂的治疗［6-7］。

本研究采用高脂饮食喂养加小剂量STZ腹腔注射的实验方法，建立模拟人类2型糖尿病合并NAFLD的实验动物模型。HE染色显示模型组大鼠肝小叶结构紊乱、肝细胞弥漫性脂肪变性，可见点状坏死灶，炎症细胞增多，说明肝组织损伤。血清中的ALT、AST酶活性升高也显示肝功能受损。模型组大鼠血清中TG、CHO、LDL-C水平明显高于正常组，说明存在严重的脂代谢紊乱。经糖肾方治疗后，明显降低糖尿病合并NAFLD大鼠血清中ALT、AST水平，并纠正了脂代谢紊乱。提示糖肾方对糖尿病合并NAFLD大鼠的肝脏脂质代谢异常有保护作用。

糖尿病的重要特征糖脂紊乱会损害过氧化和抗氧化之间的平衡，抑制抗氧化水平和增加自由基水平［8-9］。此外，氧化应激过程中，酶促和非酶促抗氧化系统的活性降低。SOD和CAT都是体内重要的抗氧化酶［10-11］，反映机体清除自由基和抗氧化损伤的能力。本研究中，模型组肝脏中的SOD、CAT水平下降可能源于STZ诱导的活性氧失活，糖肾方治疗后通过降低氧化应激反应来提升抗氧化酶体系的活性。非酶促抗氧化系统中的VE会转移其酚醛氢键到过氧化多不饱和脂肪酸的过氧化氢自由基，打破自由基链反应并避免细胞膜脂质过氧化。NO和NOS也是机体抗氧化能力的重要指标。NO是一种细胞信使分子，由L-精氨酸NOS催化下合成。NOS过度表达可以产生大量的NO，诱导氧化损伤，生成过氧亚硝基阴离子，抑制线粒体代谢，介导其他毒性自由基产生，促进脂质过氧化反应［12］。本实验中糖尿病模型组大鼠肝组织的SOD、CAT和VE活性明显降低，而NO、NOS水平显著增加，说明机体氧化应激水平增高，导致肝损伤。

2型糖尿病合并NAFLD属于中医“消渴”、“胁痛”等范畴。多因先天禀赋不足，加之过食。病因不外肥甘厚味、劳逸过度等导致脾胃运化失常，肝气失疏泄，则气机郁滞。糖肾方由黄芪、生地、三七等中药组成，以益气养阴、活血化瘀为主要功效［3］。糖肾方中的有效成分黄芪多糖和大黄素可提高肝脏的抗氧化能力，降低脂质沉积；黄芪总皂苷和三七总皂苷能够调节免疫、改善大鼠血流动力学参数；大黄素可以降低血糖、血脂、改善胰岛素抵抗；生地黄梓醇能够降血糖，保护心血管。实验结果显示糖肾方可不同程度地提高肝组织的SOD、CAT和VE活性，降低NO、NOS水平，表明模型大鼠抗氧化能力提高、氧化应激减轻、肝组织炎症和病理损伤缓解。

综上所述，笔者通过建立2型糖尿病合并NAFLD的大鼠模型，证实模型组大鼠存在明显的氧化应激反应。糖肾方对糖尿病大鼠肝脏具有一定的保护作用，其机制可能是通过抑制体内异常的氧化应激反应和改善脂质代谢异常来发挥作用。

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（2015-02-13收稿 2015-03-15修回）

（本文编辑 闫娟）

Effects of Tangshen Formula on liver oxidative stress and pathologic changes in typeⅡdiabetic rats

LI Xin1，2，GU Ligang1，ZHAO Tingting2，YANG Xin2，ZHANG Yun2，ZHANG Haojun2，YAN Meihua2，DONG Xi2，ZHAO Hailing2，WEN Yumin2，LI Ping2△
1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 China-Japan Friendship Hospital△

ObjectiveTo investigate the effects of Tangshen Formula on liver oxidative stress in diabetic rats，and their mechanisms thereof．MethodsRat model of type 2 diabetes mellitus and nonalcoholic fatty liver disease was estab⁃lished by intraperitoneally injecting small dose of chain urea with cephalosporins（STZ）and feeding high fat fodder．The model rats were randomly divided into control group，model group，Tangshen Formula group and metformin group．The se⁃rum levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），triglyceride（TG），cholesterol（CHO），low density lipoprotein-cholesterol（LDL-C），and superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），vitamin E（VE），nitric oxide（NO）and nitric oxide synthase（NOS）in liver were compared between four groups.Changes of pathological morphology were ob⁃served under light microscopy.ResultsThere were significantly decrease in serum levels of ALT，AST，TG，CHO，LDL-C in Tangshen Formula group and metformin group compared with those of model group.There were significantly higher levels of SOD，CAT and VE，and lower levels of NO and NOS of liver homogenate in Tangshen Formula group than those of model group.There were higher levels of SOD and CAT，and lower levels of NO and NOS in liver homogenate in metformin group than those of model group.HE staining showed that liver fatty degeneration was significantly reduced in metformin group and Tangshen Formula group compared with that of model group.ConclusionThe fatty liver in type 2 diabetic rats is signifi⁃cantly improved by Tangshen Formula treatment，which is probably associated with the regulation of the response level to oxi⁃dative stress in liver．

Tangshen Formula；diabetes mellitus，type 2；liver injury；oxidative stress

R285.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.009

国家自然科学基金资助项目（81173422）；国家国际科技合作专项课题（2011DFA31860）

1北京中医药大学（邮编100029）；2中日友好医院

李忻（1980），女，助理研究员，博士在读，主要从事中西医结合基础研究

△通讯作者E-mail：lp8675@163.com