艾烟与香烟对载脂蛋白 E基因敲除小鼠自主行为与海马 GFAP表达的影响

刘钧天,崔莹雪,黄玉海,黄畅,黄剑,赵百孝,韩丽,杨佳,王磊

(1.北京中医药大学附属护国寺中医医院,北京 100035;2.首都医科大学附属北京中医医院,北京 100010;3.中国中医药科技开发交流中心,北京 100010;4.北京中医药大学针灸推拿学院,北京 100029)

艾灸作为针灸学科的重要组成部分,从古至今广泛应用于疾病治疗及预防保健等方面。古代医家都提倡用艾灸防病强身,延缓衰老,如《医学入门》记载:“凡一年四季各要熏一次,元气坚固,百病不生。”艾烟作为艾灸过程中的重要组成部分,其主要成分与生物活性均参与到艾灸疗效的发挥过程中。我们前期研究证明艾烟可提高人体自主神经系统活力[1],改善SAMP8小鼠脑中的氧化应激状态[2]。初步提示艾烟可以改善中枢神经系统功能。

载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠作为一种新型动物模型广泛应用于阿茨海默病发生机制的研究中。许多研究证实ApoE基因缺失对认知功能的影响尤其是老化后出现的智力下降与氧化性损伤增强有关[3-4]。

为进一步了解艾烟对阿茨海默病小鼠模型学习记忆功能与海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。本实验以ApoE-/-小鼠为模型,通过对比观察艾烟暴露与香烟暴露两种不同干预方式对其自主行为及脑组织海马中GFAP表达的影响,探讨艾烟对脑组织衰老的干预作用,以期为探索艾灸疗法延缓衰老机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用清洁级8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)27只,C57BL/6小鼠13只,体重30 g,购自北京大学动物医学中心[许可证为SCXK(京)2011-0012]。ApoE-/-小鼠采用高脂饲料喂养,C57BL/6小鼠采用标准饲料喂养,自由进水;饲养环境温度 22℃±2℃,相对湿度 50%～60%,保持 12 h光照(8:00-20:00)和黑暗(20:00至次日8:00)交替循环。

小鼠购进后,适应性饲养1星期,干预12星期。按随机数字表法将ApoE-/-小鼠随机分为ApoE-/-模型组、艾烟组、香烟组3组(每组9只),并将13只C57BL/6小鼠作为空白对照组进行对照。在干预12星期后,所有小鼠进行行为学测试,随后全部处死,每组随机选取6只小鼠大脑进行免疫组织化学检测。

1.2 主要实验材料、仪器及试剂

自制细艾条(直径0.5 cm×长20 cm,河南南阳汉医艾绒有限公司);香烟(中南海牌,焦油含量 10 mg/支);自制带孔玻璃缸(1 m×1 m×1 m,顶层玻璃正中设一直径5 mm圆孔);光散射式数字粉尘测试仪(北京宾达绿创科技有限公司);小鼠自主行为测试仪(UGO Basile);GFAP兔抗小鼠抗体(Abcam);中性树胶封片剂;多聚甲醛,中性树胶及其他生物试剂(Sigma)。

1.3 实验步骤

1.3.1 空白暴露

将空白对照组与ApoE-/-模型组小鼠分别暴露于玻璃缸中20 min。

1.3.2 艾烟、香烟干预

1.3.2.1 艾烟干预

将调试好的粉尘测试仪置于玻璃缸中间,将艾烟组小鼠自由暴露在玻璃缸中,点燃自制细艾条,从玻璃缸上方的圆孔将点燃的一端插入,令艾烟充满玻璃缸。根据前期实验结论[5],控制艾烟浓度为 5～15 mg/m3。用粉尘测试仪测试其浓度达到预定范围后(此过程艾条燃烧约 15 s),将艾条取出,迅速封闭圆孔。此后每隔 3 min记录一次浓度数值,使浓度稳定在 10 mg/m3左右。若数值高于 15 mg/m3,可将上方玻璃盖稍微移动,令艾烟散去部分后迅速将盖子移回;若数值低于5 mg/m3,可再将点燃的艾条由圆孔插入,以补充艾烟。20 min后,取出小鼠,每星期干预6 d,共干预12星期。

1.3.2.2 香烟干预

除将艾条换成香烟,香烟浓度及干预方式与艾烟组相同。在进行香烟干预时要保证与其他组别严格隔离,避免其他组别嗅到香烟。

1.3.3 自主活动实验

小鼠自主活动测试仪,定时为 5 min,将小鼠放入实验活动仪反应槽中,盖上盖子后开始进行实验,当小鼠站立时,反应槽周围上方的红外线探头探测到信号改变,当小鼠没有站立,而是在爬行时,反应槽周围下方的红外线探头探测到信号改变,数据均自动记录。

1.3.4 标本制备与图像采集

随机选取6只,用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠,经一侧颈总动脉先注射200 mL生理盐水灌注冲洗后,再灌注 4%多聚甲醛直至流出的液体澄清。静置30 min后开颅取脑(视交叉与乳头体之间的脑组织),置4%多聚甲醛中固定过夜,流水冲洗30 min,用各级乙醇脱水,苯透明,浸蜡,常规包块。转化切片机切片,制备脑冠状面切片,片厚约6 μm。

免疫组织化学超敏法[6]一抗为兔抗小鼠GFAP多倍体克隆抗体(美国Abcam公司)。其中A液,即用型过氧化物酶阻断剂;B液,即用型非免疫血清;C液,即用型生物素标记二抗;D液,即用型链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶标记三抗。实验步骤严格按照说明书进行,替代实验用0.01 mol/mL PBS代替一抗,其他步骤不变,结果为阴性。

于400倍Olympus显微镜下观察海马切片上GFAP阳性细胞形态和分布特征;用Leica Qwin Plus图像分析仪计数每张切片5个视野海马结构0.1 mm2GFAP的积分光密度(IOD)值。

1.4 统计学方法

所有数据应用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示。符合正态性和方差齐性的数据,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 自主活动成绩分析

空白组小鼠活动距离与站立次数均高于模型组小鼠(P＜0.05),表明ApoE-/-小鼠会降低中枢神经系统的兴奋性。艾烟组移动距离高于模型组(P＜0.05),但与空白组无差别,站立次数与模型组无差异,但低于空白组。表明艾烟可以提高ApoE-/-小鼠活动性,增强其运动能力。香烟组没有表现出与模型组、艾烟组的明显差异,但香烟组活动距离与站立次数均差于空白组(P＜0.05),说明香烟组小鼠活动能力低于正常小鼠。详见图1-2,表1。

图1 各组小鼠自主活动移动距离

图2 各组小鼠自主活动站立次数

表1 各组小鼠的自主活动行为 (±s)

表1 各组小鼠的自主活动行为 (±s)

注:在第 1星期适应性喂养中由于饲养环境改变模型组小鼠死亡 3只,香烟组死亡1只。与模型组比较1)P＜0.05;与空白组比较2)P＜0.05

组别 n 活动距离(mm)站立次数(次)空白组 13 580.54±130.511) 36.79±18.931)模型组 6 304.00±76.87 10.11±5.49艾烟组 9 477.93±81.791) 18.37±9.362)香烟组 8 359.54±106.612) 12.46±7.832)

2.2 各组小鼠海马中GFAP蛋白表达

GFAP免疫阳性反应在细胞中呈现两种形态,一种原浆性星形胶质细胞体型较大,呈圆形或椭圆形,突起粗短、数量较少,GFAP免疫阳性产物聚集细胞体一侧;另一种纤维性星形胶质细胞体型较小,呈星性或多角形,突起细长、分部广泛,GFAP免疫阳性产物充满细胞体(图3)。模型组小鼠海马中GFAP免疫反应产物积分光密度值明显高于空白组与艾烟组(P＜0.05)(表2)。香烟组小鼠海马 GFAP表达高于艾烟组与空白组(P＜0.05)。说明艾烟较香烟能减低ApoE-/-小鼠海马中GFAP的表达。

表2 各组小鼠海马结构GFAP免疫反应产物的积分光密度值 (±s)

表2 各组小鼠海马结构GFAP免疫反应产物的积分光密度值 (±s)

注:与模型组比较1)P＜0.05,2)P＜0.01;与空白组比较3)P＜0.05;与香烟组比较4)P＜0.05

组别 n GFAP免疫反应产物的积分光密度值空白组 6 4.30±1.522)模型组 6 13.90±4.06艾烟组 6 7.60±2.281)4)香烟组 6 12.40±4.683)

图3 各组小鼠海马CA3区GFAP表达(×400)

3 讨论

本实验对各组小鼠进行自主活动观察,发现模型组小鼠自主活动移动距离和站立次数均比空白组小鼠减少,差异均有统计学意义,表明ApoE-/-小鼠的活动性降低,运动能力减弱,对新环境认知能力较差,对潜在危险缺乏警惕。许多研究证实,ApoE-/-小鼠在幼龄时就会出现中枢神经系统兴奋性降低甚至认知功能障碍,而这种情况会随着年龄的增加日渐加重[7]。艾烟干预后,其自主活动移动距离较模型组明显增多,说明艾烟可使 ApoE-/-小鼠中枢神经系统兴奋性提高,运动能力增强,对新环境有更好的认知与适应性。本研究中,艾烟组小鼠表现优于香烟组小鼠,但未产生统计学差异,如果加大样本量,期望能出现统计学差异。

星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多、功能最复杂的一种胶质细胞,几乎占脑容量的50%以上,对神经元的存活、脑组织的修复起重要作用[8]。GFAP作为一个典型的星形胶质细胞标记物,会随动物与人大脑年龄的增长而表达增加[9]。而ApoE-/-小鼠与衰老野生小鼠脑中GFAP蛋白含量同样呈现高表达,说明ApoE-/-小鼠与衰老有着非常密切的联系[10]。亦有研究表明,在阿茨海默病(AD)的病理过程[11]中,星形胶质细胞会被β淀粉样蛋白激活,大量增殖,产生细胞炎性分子、氧自由基等物质并启动炎性反应,促进神经细胞的损伤与凋亡,大大加速AD进程。GFAP是星形胶质细胞构成中的一种重要的细胞骨架蛋白,有着保护星形胶质细胞的作用,其大量表达以对抗脑中氧化损伤。本研究中,空白组与艾烟组海马GFAP蛋白表达低于模型组与香烟组,间接说明,两组小鼠脑中氧化损伤较小,衰老程度降低。因此提示艾烟可以通过降低脑内氧化应激损伤起到保护脑组织进而抗衰老的作用。

艾烟的安全性与多种生物活性同样倍受关注。在对艾烟进行系统毒理学分析后,得出其半数致死浓度LC50=11117 mg/m3[12];亚慢性毒理实验说明艾烟不能引起大鼠脏器萎缩与水肿[13];在艾烟致畸与致突变试验中发现,高于临床浓度百倍的艾烟冷凝物才会产生潜在的致畸与致突变特性[14-15]。本课题组前期研究亦证实,临床浓度(2.5～3.5 mg/m3)艾烟对大鼠其他脏器不会产生任何病理改变,且不会引起全身过敏反应[16]。总之,各项研究结果都说明临床浓度艾烟的基本安全性。然而,香烟的毒理研究发现香烟烟雾对小鼠各系统有较强的急性、慢性毒性作用[17]与致突变效应[18],说明香烟对人体会产生各种可能的危害。

艾烟是艾灸过程中,艾绒燃烧产生的烟气,其中挥发性成分有26种[19]。香烟中的主要芳香成分也有165种[20]。早在1949年R.W.Monorieff就提出“气味的立体化学论”这一理论,认为当空气中气味分子适合于嗅神经的某些辅助性受体部位的时候,人类或动物就会嗅到它们。这一理论经过多年发展完善,Buck L等[21]在研究中阐明不同的嗅觉感受器内涵特殊的受体蛋白,当特定气味分子被嗅觉感受器识别,就会引发其动作电位,由嗅丝传递到嗅球被特殊的受体蛋白识别。通过僧帽细胞和丛状细胞轴突组成的嗅束将信号投射到初级嗅觉皮质中枢,最终可以投射到下丘脑、边缘系统、海马等部位[22],直接参与到情绪调节,学习记忆的识别、编码与储存。因此,我们推测艾烟与香烟也是通过干预嗅觉系统的神经递质,影响嗅觉传导通路,从而改善情绪以及学习记忆功能,增强中枢神经系统的兴奋性。

艾烟可提高ApoE-/-小鼠中枢神经系统兴奋性,并通过改善脑中氧化应激损伤,降低GFAP蛋白在海马的表达起到延缓大脑衰老的作用。

[1]Cui Y, Zhao B, Huang Y, et al. Effects of moxa (Folium Artemisiae argyi)smoke exposure on heart rate and heart rate variability in healthy young adults: A randomized, controlled human study[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013,(2013):510318.

[2]孟笑男,徐焕芳,崔莹雪,等.艾燃烧生成物对快速老化模型小鼠大脑 SOD、MDA和 GSH-Px的影响[J].环球中医药,2011,4(6):413-415.

[3]Fisher A, Brandeis R, Chapman S, et al. M1 muscarinic agonist treatment reverses cognitive and cholinergic impairments of apolipoprotein E-deficient mice[J]. J Neurochem, 1998,70(5):1991-1997.

[4]Kitagawa K, Matsumoto M, Hori M, et al. Neuroprotective effect of apolipoprotein E against ischemia[J]. Ann N Y Acad Sci, 2002,977:468-475.

[5]许焕芳,崔莹雪,黄茶熙,等.艾燃烧生成物对快速老化模型小鼠SAMP8血清抗氧化酶的影响[J].中国针灸,2012,32(1):53-57.

[6]张洁,宿宝贵.电针对脑梗塞大鼠海马结构内 GFAP免疫阳性细胞的形态学影响[J].解剖学研究,2010,32(1):6-9.

[7]Segev Y, Michaelson DM, Rosenblum K. ApoE epsilon4 is associated with eIF2alpha phosphorylation and impaired learning in young mice[J]. Neurobiol Aging, 2013,34(3):863-872.

[8]侯德仁,薛俐,陈坤,等.丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠海马GFAP和 VEGF的影响[J].中南大学学报(医学版),2010,53(2):111-115.

[9]Haley GE, Kohama SG, Urbanski HF, et al. Age-related decreases in SYN levels associated with increases in MAP-2, apoE, and GFAP levels in the rhesus macaque prefrontal cortex and hippocampus[J].Age (Dordr), 2010,32(3):283-296.

[10]Choi J, Forster MJ, McDonald SR, et al. Proteomic identification of specific oxidized proteins in ApoE-knockout mice: relevance to Alzheimer’s disease[J]. Free Radic Biol Med, 2004,36(9):1155-1162.

[11]Kuchibhotla KV, Lattarulo CR, Hyman BT, et al. Synchronous hyperactivity and intercellular calcium waves in astrocytes in Alzheimer mice[J]. Science, 2009,323(5918):1211-1215.

[12]兰蕾,常小荣,谭静,等.艾烟的急性毒理试验[J].光明中医,2011,27(10):1992-1995.

[13]兰蕾,张国山,石佳,等.艾烟对大鼠的亚慢性毒理试验一般生理性指标分析[J].时珍国医国药,2014,25(5):1241-1244.

[14]韩丽,刘平,胡海,等.艾烟中可吸入颗粒诱发染色体畸变效应的实验研究[J].中国中医药信息杂志,2013,20(1):34-36.

[15]韩丽,胡海,刘平,等.艾烟中可吸入颗粒物致鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验[J].中华中医药杂志,2013,28(6):1860-1863.

[16]王磊,哈略,韩丽,等.平均临床浓度艾烟下的豚鼠全身过敏反应实验研究(英文)[J].中华中医药杂志,2014,29(5):1477-1483.

[17]顾小红,周颖婷,张淑华,等.香烟烟雾水溶物对小鼠急慢性毒性实验的研究[J].嘉兴学院学报,2008,24(6):29-31.

[18]高永,郝恩柱,倪艳波.香烟和绿茶对辐射致突变效应的影响[J].中华放射医学与防护杂志,2006,26(4):355-357.

[19]靳然,赵百孝,于密密,等.艾燃烧生成物组分固相微萃取气相色谱质谱法定性分析[J].北京中医药大学学报,2011,51(9):632-636.

[20]黄映凤,杨君,郭伟强,等.中药指纹图谱对香烟质量控制的启示[J].理化检验(化学分册),2009,47(1):119-124.

[21]Buck L, Axel R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition[J]. Cell, 1991,65(1):175-187.

[22]Insausti R, Marcos P, Arroyo-Jimenez MM, et al. Comparative aspects of the olfactory portion of the entorhinal cortex and its projection to the hippocampus in rodents, nonhuman primates, and the human brain[J]. Brain Res Bull, 2002,57(3-4):557-560.