丹参酮ⅡA对慢性心力衰竭心肌重构的影响及其机制研究*

冯　俊　陈华文　李树生

（华中科技大学同济医学院，湖北武汉430030）

·研究报告·

丹参酮ⅡA对慢性心力衰竭心肌重构的影响及其机制研究*

冯俊陈华文李树生

（华中科技大学同济医学院，湖北武汉430030）

目的观察丹参酮ⅡA通过调控mir-133水平对慢性心力衰竭大鼠心肌重构的影响。方法SD大鼠行腹主动脉缩窄术建立心力衰竭模型，给予连续12周的丹参酮ⅡA治疗，miR-133拮抗剂组同时给与皮下植入渗透泵持续泵入拮抗剂antagomirs；分析12周后大鼠心肌心脏及左心室质量指数、凋亡指数、胶原含量及caspase-9、结缔组织生长因子（CTGF）、RhoA蛋白水平。结果与假手术组比较，手术组心脏及左心室质量指数、凋亡指数和胶原含量增加（P＜0.05），caspase-9、CTGF、RhoA蛋白水平表达上升（P＜0.05）；丹参酮ⅡA处理组大鼠各指标均有改善（P＜0.05）；皮下连续泵入antagomirs能够部分消除丹参酮ⅡA的抗心肌重构作用（P＜0.05）。结论丹参酮ⅡA可能通过上调miR-133水平，从而调控caspase-9、CTGF、RhoA蛋白水平的表达发挥抗心肌重构的作用。

丹参酮ⅡAmir-133心力衰竭心肌重构

心室肌重构是心力衰竭的独立危险因素，随着心室肌组织重构的发生及发展，最终导致心肌缺血、心律失常和猝死［1］。研究发现，我国传统中药丹参的主要成分丹参酮ⅡA具有抗心室肌重构的作用［2-4］；最近研究发现，mir-133可调节相关因子如caspase-9［5］、结缔组织生长因子（CTGF）［6］、RhoA等［7］表达实现抗心肌重构的作用；笔者的前期研究已经发现，丹参酮ⅡA可以升高心力衰竭大鼠下降的mir-133 mRNA水平［8］。本实验研究丹参酮对mir-133的靶基因caspase-9、CTGF、RhoA等的影响，进一步探讨丹参酮ⅡA此作用的可能机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物健康成年雄性SD大鼠40只，月龄2个月，体质量250～300 g，同济医学院动物实验中心提供。

1.2试剂与仪器丹参酮ⅡA磺酸钠注射液，上海第一生化药业有限公司产品；国产分析纯，武汉康盛医药科技有限公司产品。

1.3分组与造模将SD大鼠随机分为4组，假手术组（Sham组）、手术组（Model组）、丹参酮ⅡA组（Model+ TanⅡA组）、miR-133抑制剂处理组（Model+TanⅡA+antagomirs组），每组10只，4组大鼠均于同一环境下饲养。采用腹主动脉缩窄法（AAC）构建慢性心力衰竭大鼠模型，10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔麻醉，仰位固定，腹部常规备毛、消毒，于腹中线开腹处理，暴露分离腹主动脉，8号针头平行置于腹主动脉旁后采用手术缝线（4－0）将两者结扎，随后抽出针头关闭腹腔。术后腹腔注射青霉素抗感染。假手术组只分离腹主动脉，不结扎。正常喂养4周。从第5周开始，丹参酮ⅡA组给予丹参酮ⅡA磺酸钠注射液［1 mL/（kg·d）］连续12周灌胃，其余两组均给予等容积0.9%氯化钠注射液，此外，miR-133抑制剂处理组还于皮下植入渗透泵持续泵入antagomirs（0.6 μmol/L）。

1.4观察指标心脏指数（HWI）及左心室质量指数（LVMI），静脉注射过量的氯化钾可使心脏止于收缩期，迅速取出心脏称重，并分离大血管、心房及右心室，用预冷的PBS液充分冲洗，滤纸吸干，称量左心室（包括室间隔）的湿重，以心脏（mg）与体质量（g）之比作为HWI，左室质量（mg）与体质量（g）之比作为LVMI。Masson染色观察心室肌胶原变化情况，将左心室中部冠状切面的心肌组织用4%多聚甲醛固定后制备成石蜡包埋切片（5 μm），脱蜡至水，按照Masson试剂盒指示方法进行染色，胶原纤维呈蓝色，心肌纤维呈红色，胞核黑蓝色。观察心肌胶原纤维含量变化。TUNEL法检测心肌细胞凋亡。大鼠处死后取出左心室，依次4%福尔马林固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋和切片（5 μm），按照TUNEL试剂盒提供的步骤进行心肌细胞凋亡的检测，统计每个视野的染色阳性细胞数，以阳性细胞所占的比例计为凋亡指数。caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平表达，采用western bolt法检测心肌caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平，取大鼠心肌组织100 mg，提取总蛋白，依次加入上样缓冲液煮沸变性、10%SDSPAGE电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗（caspase-9、CTGF、RhoA）孵育过夜，二抗孵育后进行ECL显示处理；Gel-Pro analyzer分析caspase-9、CTGF、RhoA的光密度，以β-actin作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

1.5统计学处理采用SPSS18.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠左心室质量指数测定结果比较见表1。与Sham组比较，Model组的HWI和LVMI均显著升高（P＜0.05）。TanⅡA处理后HWI和LVMI均明显降低（P＜0.05），说明TanⅡA可抑制左心室重构，而Model+ TanⅡA+antagomirs组的HWI和LVMI较Model+TanⅡA组上升（P＜0.05），说明antagomirs可部分抵消TanⅡA抑制左心室重构。

表1　各组心脏指数和左心室指数结果比较（mg/g，）

表1　各组心脏指数和左心室指数结果比较（mg/g，）

与Sham组比较，△P＜0.05；与Model组比较，*P＜0.05；与Model+TanⅡA组比较，▲P＜0.05，下同。

组别nHWILVWI Sham组102.62±0.052.07±0.04 Model组103.24±0.15△2.77±0.13△Model+TanⅡA组102.76±0.08*2.15±0.03*Model+TanⅡA+antagomirs组103.15±0.12△▲2.68±0.08△▲

2.2各组Masson染色观察心肌胶原含量变化比较

见图1。正常心肌细胞呈红色，胶原呈绿色。Sham组心肌间隙可见少量胶原纤维，排列整齐；Model组大鼠心肌间隙见大量胶原堆积，并有微瘢痕形成，心肌纤维排列紊乱，间质胶原纤维增生，以血管周围为明显，非血管区胶原纤维增生程度比血管周围轻；Model+TanⅡA组可见不同程度胶原沉积于细胞间质，胶原纤维排列紊乱，间质纤维增生，以血管周围为明显，但总体胶原纤维增生程度较Model组明显减轻。Model+TanⅡA+ antagomirs组胶原纤维增生程度较Model+TanⅡA组明显。

图1　各组大鼠心肌心肌胶原含量变化

2.3各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较见表2和图2。与Sham组比较，Model组凋亡指数明显升高（P＜0.05），而TanⅡA可以降低慢性心力衰竭大鼠心肌凋亡指数（P＜0.05）；皮下泵入antagomirs可部分拮抗TanⅡA的作用（P＜0.05）。

2.4Caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平表达见表3和图3。与Sham组比较，Model组心肌细胞的caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平上升（P＜0.05），TanⅡA可使三者的蛋白水平降低，Model+TanⅡA组与Model组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；皮下连续泵入antagomirs能够部分消除TanⅡA的作用，使caspase-9、CTGF、RhoA蛋白水平上升（P＜0.05）。

表2　各组大鼠心脏凋亡指数比较（）

表2　各组大鼠心脏凋亡指数比较（）

组别n凋亡指数Sham组100.05±0.01 Model组100.44±0.03△Model+TanⅡA组100.06±0.01*Model+TanⅡA+antagomirs组100.35±0.02△*▲

图2　各组大鼠心肌心肌细胞凋亡指数比较

表3　各组心脏caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平比较（）

表3　各组心脏caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平比较（）

组别nCaspase-9CTGFRhoA Sham组101.00±0.00 Model组102.21±0.19△Model+TanⅡA组101.36±0.08*1.00±0.001.00±0.00 2.01±0.12△2.18±0.19△1.26±0.12*1.27±0.09*Model+TanⅡA+antagomirs组101.78±0.12△*▲1.66±0.08△*▲1.83±0.18△*▲

图3　各组大鼠心肌心肌caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平水平比较

3　讨论

丹参酮ⅡA是丹参乙醚提取物中的脂溶性有效成分。研究表明其具有抗心室重构的作用，治疗各种原因导致的慢性心力衰竭，能明显改善心功能［9］。

本实验用腹主动脉缩窄法建立慢性心力衰竭大鼠模型，发现手术组术后左心室质量指数和凋亡指数明显升高，Masson染色显示大量心肌胶原沉积，间质胶原纤维增生。给予丹参酮ⅡA处理后，和手术组相比，大鼠左心室肥厚指标、凋亡指数以及心肌胶原含量等明显改善，提示丹参酮ⅡA可抑制和逆缓左心室重构。此外，在给予AAC大鼠丹参酮ⅡA处理的同时，皮下植入渗透泵连续泵入miR-133的抑制剂antagomirs以证明丹参酮ⅡA是否通过调控miR-133来抑制心力衰竭大鼠左心室重构，经antagomirs处理后，左心室肥厚指标、凋亡指数以及心肌胶原含量变化情况较丹参酮ⅡA组恶化，表明antagomirs可以下调miR-133的表达从而部分消除丹参酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重构的作用。

Caspase-9是线粒体介导的细胞凋亡的关键调节因子之一。在凋亡刺激下，细胞色素C以dATP的形式从线粒体释放到细胞质中，和凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）和caspase-9形成凋亡复合体。凋亡复合体激活caspase-9，然后蛋白水解激活caspase-3，共同参与细胞凋亡［10］。细胞外基质（ECM）是保持心肌组织强度和功能完整性的必要物质。高血压和压力负荷等病理刺激下，ECM蛋白质在心脏过量积聚。CTGF是一种由细胞外基质合成的分泌性蛋白，是一个重要的组织纤维化介质，在心肌重塑过程中，心肌细胞也可分泌CTGF［11］。RhoA是小GTP-结合蛋白的成员之一，其最重要的功能是调节肌动蛋白细胞骨架，其次在基因转录、细胞周期调控、膜泡运输等过程中也起重要作用［20］。RhoA激酶依赖性通路也可通过收缩血管平滑肌细胞、作为G蛋白耦联受体的下游目标、激活心脏和全身肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性等途径参与心力衰竭大鼠的肾血管收缩和心肌肥厚，并参与调节心脏形态的变化和基因表达的变化［12-13］。

本实验慢性心力衰竭模型组大鼠caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白表达水平上升，给予丹参酮ⅡA干预后caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白表达水平均明显降低，提示丹参酮ⅡA可能通过抑制caspase-9、CTGF、RhoA的表达来抑制左心室重构。此外，在给予模型大鼠丹参酮ⅡA处理的同时，给予miR-133的抑制剂干预后，caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白表达水平明显下降，表明antagomirs可以下调miR-133的表达从而部分消除丹参酮ⅡA的作用。以上证据表明，miR-133在丹参酮ⅡA抗心室重构过程中发挥着重要的作用，而丹参酮ⅡA通过上调miR-133水平抗心室重构的可能的途径是通过miR-133来调控相关蛋白如caspase-9、CTGF、RhoA等的表达，进而影响心室重构。

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The Effect and Mechanism of TanshinoneⅡA on Myocardial Remodeling in Rats with Heart Failure

FENG Jun，CHEN Huawen，LI Shusheng.
Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College，HuaZhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430030，China

Objective：To investigate the effect of miR-133 on myocardial remodeling in rats with chronic heart failure induced by TanshinoneⅡA and its mechanism.Methods：The rats with heart failure were induced by Abdominal aortic constriction（AAC）.The TanⅡA injection was applied in the continuous twelve weeks，while part of the rats were subcutaneously implanted with osmotic pump to pump into the antagomirs（inhibition of miR-133）.Twelve weeks later，cardiac index，left ventricular mass index，apoptosis index，collagen content and the protein expression of caspase-9，CTGF and RhoA were Analysized.Results：Compared with Sham group，AAC operation could increase cardiac index，left ventricular mass index，apoptosis index and collagen content（P＜0.05），and enhance the protein expression of caspase-9，CTGF and RhoA（P＜0.05）；TanⅡA treatment on AAC rats could improve those items above with significant difference（P＜0.05）.Subcutaneous pumping of antagomirs could abolish these effects of TanⅡA.Conclusions：TanⅡA may resist the cardiac remodeling of the rats with heart failure by lift regulating miR-133 levels to regulate the protein expression of caspase-9，CTGF and RhoA.

TanshinoneⅡA；MiR-133；Heart failure rats；Cardiac remodeling

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2069-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.001

2015-08-12）

国家自然科学基金资助项目（81202825）