麻黄细辛附子汤对正常小鼠外感及肾阳虚模型小鼠外感影响的比较*

孙启慧　相美容　王朋展　侯衍豹　容　蓉　杨　勇，2△

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.山东省经方研究重点实验室，山东济南250355）

·研究报告·

麻黄细辛附子汤对正常小鼠外感及肾阳虚模型小鼠外感影响的比较*

孙启慧1相美容1王朋展1侯衍豹1容蓉1杨勇1，2△

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.山东省经方研究重点实验室，山东济南250355）

目的探讨麻黄细辛附子汤（MXF）对正常小鼠外感和肾阳虚模型小鼠外感干预作用效果差异。方法KM小鼠按体质量和肛温随机分成6组，并设空白对照组。腹腔注射苯甲酸雌二醇（8 mg/kg）法复制肾阳虚小鼠模型，流感病毒H1N1鸡胚尿囊液（血凝滴度为1∶320）滴鼻感染小鼠，建立肾阳虚小鼠外感模型。感染1 d后给分别给MXF和利巴韦林药物干预，连续给药6 d，每日1次，观察并记录小鼠的体质量、肛温变化，死亡数和死亡时间，比较各脏器指数变化。结果肾阳虚外感模型建立成功，肾阳虚模型建立成功后，小鼠死亡多发生在病毒感染后的2～5 d之内；与正常组比较，其余6组小鼠体质量显著降低（P＜0.01）；肾阳虚外感组及肾阳虚外感利巴韦林组的肛温明显降低（P＜0.01），肾阳虚外感组及肾阳虚外感利巴韦林组的肺指数明显升高（P＜0.05）。与肾阳虚外感组比较，肾阳虚外感MXF组小鼠死亡率、肺指数均有所降低，并且小鼠肛温显著回升（P＜0.05）；与正常外感组比较，正常外感MXF组小鼠死亡率、肺指数均有所降低，肛温也出现回升趋势；H1N1感染小鼠，对照组无死亡，正常外感组死亡率10%，肾阳虚外感组死亡率20%，利巴韦林分别给药干预后死亡率分别是30%和10%，MXF给药干预后正常外感组和肾阳虚外感组均无死亡现象，与正常组和肾阳虚外感模型组比较，MXF有降低小鼠死亡率的趋势。结论MXF更适合于肾阳虚外感病证，为临床上方证相关用药提供了一定的实验依据。

肾阳虚模型外感正常小鼠外感流感病毒H1N1MXF

病毒性流行性感冒（流感）每年均在全世界流行，其波及范围极广，每年全球大约有10～20%的人感染流感，其中2009年全球爆发的H1N1甲型流感造成全球至少20万人死亡［1］。流感一般是由流感病毒引起的上呼吸道病毒感染性疾病，发病率高，潜伏期短，易暴发流行，是人类最常见的上呼吸道感染性疾病之一［2］。现代医学认为流感临床症状较重，起病急骤，有畏寒、发热、头痛、头晕、全身酸痛、乏力等，可伴有咽痛、流涕、流泪、咳嗽等呼吸道症状；并发症发生率高，特别是肺炎，可引起死亡，年迈体弱和幼年多病或有慢性基础病患者为其高危人群［3-4］。目前，抗流感病毒药物研究已取得初步成果，正式上市的抗流感药物大体分为两类：金刚烷胺和金刚乙胺类；神经氨酸酶（NA）抑制剂，逐渐发现流感病毒对这些药物产生了不同程度的耐药性［5］。中医药治疗流感源远流长，疗效显著［6］，麻黄细辛附子汤（MXF）始载于《伤寒论》，为治疗阳虚兼外感经方之一。本方组方严谨，由麻黄、细辛、炮附子组成，麻黄发汗解表，附子温里助阳，细辛温化寒饮，既助麻黄解表，又配合附子逐里之寒饮。全方具有助阳解表、温经散寒之功效，用于治疗素体阳虚，复感寒邪，恶寒发热，寒重热轻，头痛无汗，四肢欠温，舌质淡，苔薄白，脉沉细等病症［7］。本研究通过比较MXF对肾阳虚外感及正常外感干预作用的差异，拟探究中药复方治疗疾病的方证相关性，为其在中医临床上的辨证论治所强调的方药与疾病的高度相关性提供实验依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物KM小鼠雄性（20±2）g，SPF级，由山东鲁抗动物实验中心提供，动物许可证号SCXK（鲁）20080002。

1.2试剂及药物苯甲酸雌二醇（宁波第二激素厂，批号140627）；流感病毒H1N1（北京地方株引自中国CDC病毒病研究所）；利巴韦林颗粒（四川百利药业有限责任公司，批号131210）；麻黄、炮附子、细辛（济南市建联中药有限公司中药饮片厂，批号20110501），经山东中医药大学李峰教授鉴定符合《中国药典》2010年版标准。

1.3仪器智能恒温控制仪（成都泰盟科技有限公司）；DT-880B型手持式人体表面温度快速筛检仪（深圳市华盛昌机械实业有限公司）；ZIL-2型小鼠自主活动仪（北京医科院药研所）；01193-YP601N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.4分组KM小白鼠按体质量和肛温随机分为正常外感组、正常外感利巴韦林组及MXF组，肾阳虚外感组、肾阳虚外感利巴韦林组及肾阳虚外感MXF组，并设空白对照组。

1.5造模1）正常外感模型的制备：KM雄性小鼠36只随机分为3组，分别为正常外感模型组、正常外感利巴韦林组、正常外感MXF组，流感病毒H1N1鸡胚尿囊液（血凝滴度为1∶320）滴鼻感染小鼠50 μL/只，对照组小鼠滴鼻接种等量的50 μL/只给予0.9%氯化钠注射液，第1日接种流感病毒，2～7 d为药物干预治疗，每天记录小鼠体质量、肛温变化，观察小鼠的精神状态、发病及死亡情况。2）肾阳虚小鼠模型的复制：KM雄性小鼠45只，参考文献方法［8］并改进造模剂量，4 mL/kg腹腔注射2 mg/mL苯甲酸雌二醇稀释液，每日1次，连续15d，复制肾阳虚模型，对照组小鼠4 mL/kg腹腔注射0.9%氯化钠注射液，于造模12～13 d进行相关指标检测，通过测定自主活动、肛温、趾温、游泳时间［9］，以此判定模型成功与否。3）肾阳虚外感小鼠模型建立：将复制成功的肾阳虚模型小鼠以体质量、肛温为变量，随机分为3组，分别为肾阳虚外感模型组、肾阳虚外感利巴韦林组、肾阳虚外感MXF组，接种流感病毒方法同正常外感模型。

1.6给药小鼠灌胃量按20 mL/kg计算，利巴韦林组剂量为0.0625 g/（kg·d），麻黄细辛附子汤剂量为2.5 g/（kg·d）均相当于人临床等效剂量。感染第2日给药，对照组、模型组以10 mL/kg的体积灌服蒸馏水，其余组灌服同体积的利巴韦林及MXF，连续给药6 d，每天灌胃1次。

1.7观察指标1）造模过程中每天测量接种流感病毒后小鼠的肛温、体质量1次，记录每天变化趋势，连续7 d。并观察过程中小鼠的临床症状如精神状况、活动度、饮食等变化。2）计算每组的死亡率：死亡率=死亡动物数（只）/动物总数（只）×100%。3）实验结束小鼠取各组小鼠肺、脾、胸腺等组织，称取脏器质量，计算脏器指数。

1.8统计学处理采用SPSS17.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，死亡率的比较采用χ2检验。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肾阳虚小鼠模型建立见表1。结果示，造模后与对照组小鼠比较，模型小鼠肛温、趾温、自主活动次数明显减少（P＜0.01）；游泳时间明显减少（P＜0.05）。结合上述指标表明肾阳虚模型建立成功。

表1　造模对小鼠肛温、趾温、自主活动、游泳时间的影响（）

表1　造模对小鼠肛温、趾温、自主活动、游泳时间的影响（）

与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别自主活动（次/10 min）游泳时间（min）模型组238.96±85.06△△37.43±12.45△对照组329.42±48.9847.77±10.48 n 43 12肛温（℃）趾温（℃）35.38±0.55△△19.02±0.49△△36.18±0.5420.07±0.33

2.2各组小鼠一般情况比较对照组小鼠皮毛干爽光滑，精神状态良好，活泼，体质量渐增。正常外感组小鼠感染初期出现不活泼、打喷嚏等症状，总体质量从第2日开始下降直至最后解剖未见回升，期间严重者甚至出现死亡。肾阳虚外感模型组小鼠感染24 h后，症状初期为不活泼、呼吸短促，挠鼻，喷嚏，后期呈现极度消瘦，尾血管发紫，部分症状严重的小鼠出现死亡，死亡多发生在感染后的2～5 d之内。

表2　各组小鼠体质量差值比较（g）

2.3各组小鼠体质量、肛温变化情况比较见表2，表3。对照组小鼠体质量有升有降，但总体呈上升趋势；从接种流感病毒起，正常外感组小鼠体质量呈持续降低趋势，到第5日降至最低，随后体质量有上升的趋势；肾阳虚外感模型组小鼠体质量从第1日开始一直呈持续降低趋势未见恢复；正常外感利巴韦林组、肾阳虚外感利巴韦林组小鼠体质量呈急剧降低趋势，未见有恢复趋势，且该组动物整体出现不健康状态，死亡率比较高，表明利巴韦林无论是治疗普通外感、还是肾阳虚外感，其治疗作用均较差；MXF干预后，正常外感组小鼠接种病后前2 d体质量呈降低趋势，给药第3日开始呈逐渐上升趋势，肾阳虚外感组小鼠MXF干预后体质量一直呈较明显上升趋势，说明MXF对肾阳虚外感小鼠体质量回升有更明显作用。接种流感病毒后对照组小鼠肛温明显高于其他组小鼠，第1日～5日与肾阳虚外感模型组及肾阳虚外感给药组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。第6日起正常外感组及正常外感利巴韦林组肛温比正常组降低（P＜0.05），肾阳虚外感MXF组肛温明显回升与正常组差别不大（P＞0.05）。与肾阳虚外感组比较，给药第5日，肾阳虚外感MXF干预组肛温明显上升，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与正常外感组比较正常外感MXF干预后肛温出现明显上升，但差别不大（P＞0.05）。利巴韦林治疗组肛温与模型组比较差别不大（P＞0.05），表明该药物对小鼠体温的回升作用不明显。

表3　各组小鼠肛温变化情况比较（℃，）

表3　各组小鼠肛温变化情况比较（℃，）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常外感组比较，△△P＜0.01；与肾阳虚外感组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别n正常组10正常外感组10正常外感利巴韦林组10正常外感MXF组10肾阳虚外感组10肾阳虚外感利巴韦林组10肾阳虚外感MXF组10第1日35.97±0.74##36.18±0.37 36.25±0.19第5日36.6±0.45##35.92±0.83 36.13±0.49 36.29±0.32 35.9±0.836.06±0.62 36.03±0.636.16±0.73 35.59±0.94**35.35±0.75**35.51±0.99**35.7±0.65**35.52±1.4**35.65±0.58**35.4±0.72**35.48±0.51**35.4±0.62**35.53±0.5**35.64±0.62**35.09±0.73**35.53±0.55*36.04±0.52 36.39±0.4#第2日第3日第4日36.28±0.8##36.38±0.82##36.28±0.57##35.85±0.64 35.82±0.93 35.82±0.46 35.92±0.57 35.88±0.57 36.23±0.24第6日第7日36.61±0.29##36.6±0.22##35.85±0.75*35.34±0.61**35.82±0.79 35.51±0.76**36.09±0.53 36.07±0.48△△35.24±1.35**35.05±1.31**35.14±0.45**35.1±0.51**36.36±0.57##36.3±0.78##

2.4各组小鼠死亡率比较见表4。结果示，H1N1感染小鼠，对照组无死亡。正常外感组死亡率10%，肾阳虚外感组死亡率20.00%，利巴韦林分别给药干预后死亡率分别是30.00%和10.00%，MXF给药干预后正常外感组和肾阳虚外感组均无死亡现象，与正常组和肾阳虚外感模型组比较，MXF有降低小鼠死亡率的趋势。

表4　各组死亡率比较n（%）

2.5各组小鼠模型脏器指数比较见表5。与正常组比较，MXF干预后正常外感组小鼠肺指数升高（P＜0.05）；与肾阳虚外感组相比，MXF干预后肺指数降低（P＜0.05），且肾阳虚外感MXF组肺指数低于正常外感MXF组（P＜0.05）。与正常组比较，正常外感组、正常外感利巴韦林组、肾阳虚外感组、肾阳虚外感利巴韦林组、肾阳虚外感MXF组胸腺指数、睾丸指数、精囊腺指数降低（均P＜0.05）。与正常外感组比较，正常MXF组脾指数升高（P＜0.05），而肾阳虚外感组、肾阳虚外感利巴韦林组下降（均P＜0.05）；肾阳虚外感组、肾阳虚外感利巴韦林组、肾阳虚外感MXF组睾丸指数、精囊腺指数降低（均P＜0.05），正常外感利巴韦林组则升高（P＜0.05）。与肾阳虚外感组比较，正常组、正常外感组、正常外感利巴韦林组胸腺指数、肾指数、睾丸指数、精囊腺指数均升高（均P＜0.05）。正常MXF组则胸腺指数、睾丸指数、精囊腺指数升高（均P＜0.05）。肾阳虚外感利巴韦林组、肾阳虚外感MXF组肾指数升高（均P＜0.05）。与正常外感利巴韦林组比较，正常外感组胸腺指数升高，而肾阳虚外感MXF组则降低（均P＜0.05）。

表5　各组小鼠模型脏器指数比较（）

表5　各组小鼠模型脏器指数比较（）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常外感组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与肾阳虚外感组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；其他给药组与正常外感利巴韦林组比较，★P＜0.05。

组别n正常组10正常外感组10正常外感利巴韦林组10肾指数1.092±0.141##1.058±0.13##1.089±0.133##正常外感MXF组100.713±0.3280.424±0.128△△0.194±0.093##1.202±0.244肾阳虚外感组100.953±0.464*0.322±0.187△△0.086±0.050**0.089±0.254**肾阳虚外感利巴韦林组100.856±0.461*0.300±0.053**△△##0.086±0.043**1.111±0.117##肾阳虚外感MXF组100.700±0.072#0.353±0.088*0.105±0.032**★1.077±0.123##肺指数脾指数胸腺指数0.616±0.083△#0.453±0.1190.195±0.036##0.871±0.415*0.375±0.1960.181±0.088##★0.707±0.1510.345±0.2920.155±0.05##睾丸指数精囊腺指数0.610±0.145##0.137±0.073##0.598±0.135*##0.124±0.043##0.793±0.159△△##0.137±0.055##0.560±0.156##0.137±0.066##0.129±0.035**△△0.050±0.042**△△0.159±0.42**△△0.060±0.019**△△0.197±0.067**△△0.047±0.022**△△

3　结论

本实验采用流感病毒滴鼻感染免疫低下小鼠，造成流感病毒肺炎模型，以死亡率、肛温、肺指数等为评价指标，实验结果示，造模后肺指数明显升高，对照组无死亡，感染模型组均出现死亡现象，且肾阳虚外感模型死亡率是正常外感的2倍，表明肾阳虚外感模型相对于正常外感模型而言有病理较严重的病理损伤，动物机体状态更差；两种模型感染流感病毒后的小鼠体质量、肛温均开始下降，给予利巴韦林治疗，两种外感模型利巴韦林效果均较差，正常外感利巴韦林组的肺指数虽然比正常外感MXF组低，但动物死亡率较高，体质量不断下降、体温降低后也未得到回升。而肾阳虚外感利巴韦林组的肺指数比肾阳虚外感MXF组还要高。以上数据反映利巴韦林治疗外感效果不理想，笔者推测该现象与利巴韦林药物的毒副作用有关［10］，也与其治疗流感病毒的针对性不强或耐药性有关。

MXF治疗正常外感、肾阳虚外感模型小鼠均有效果，但相对于正常外感模型而言，MXF对肾阳虚外感模型小鼠的体质量恢复增长更明显。在肺指数反映的炎性损伤指标中，在肾阳虚外组比正常外感组更严重的肺组织损伤基础上，MXF肾阳虚外感组比MXF正常外感组的肺指数反而更低些，表明MXF对肾阳虚外感模型有更好的治疗作用；另外肾阳虚外感MXF组与正常外感MXF组比较，在动物体质量恢复、肛温回升方面，也表现出更好的药效作用，这些均反映了中医方证相关的合理性和必要性。

本研究以正常小鼠外感和肾阳虚小鼠外感为研究对象，对比研究《伤寒论》经方MXF对两种病证的干预效果，同时以西药利巴韦林作为阳性对照药参考。本实验发现，利巴韦林治疗这两种病证的效果均不理想，MXF治疗这两种外感模型均有作用，相对于正常外感组，MXF治疗的肾阳虚外感组无论在动物体重恢复、肛温回升、肺指数等方面均表现出较好治疗效果。这为中医的临床方证相应，辩证施证提供进一步的实验依据和支持，同时也为流感的高危人群防治（肾阳虚外感）研究提供参考。

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Intervention Comparison of Mahuang Xixin Fuzi Decoction on Influenza Virus in Normal Mice and Kid-ney-yang Deficiency Mice Model

SUN Qihui，XIANG Meirong，WANG Pengzhan，et al.
Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Jinan 250355，China

Objective：To investigate the difference in intervention of Mahuang Xixin Fuzi decoction on normal mice and Kidney-yang deficiency mice model with influenza virus.Methods：KM mice were randomly divided into six groups by weight and anus temperature，including the normal group.The Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus group and intervened by ribavirin or MXF group and so on，according to the weight and rectal temperature.Kidney-yang deficiency model mice were established by intraperitoneal injection of estradiol benzoate（8 mg/kg）.Mice were infected with influenza virus H1N1 allantoic fluid（Hemagglutination titer 1∶320）by intranasal to establish the mice model of influenza disease with kidney-yang deficiency.After infection the mice were treated for 6 days.Body weight and rectal temperature changes，mortality and survival time were observed，comparing the visceral index.Results：After the model established，the infected mice died in 2～5 days. Compared with the normal group，the weight of other groups decreased significantly（P＜0.01）；the Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus group and intervened by ribavirin decreased significantly（P＜0.01），and their lung index decreased（P＜0.05）.Compared with the normal group，the other index of mice intervened by MXF became normal.After infected with H1N1，there were no death in normal group；the death rate of the normal infected with influenza virus was 10%；the Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus was 20%；the group intervened by ribavirin was 30%and 10%；and there were no death between the group intervened by MXF，which indicated that the MXF could decrease the death rate of mice.Conclusion：MXF hasbetter intervention for the Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus，providing a certain reference value for the clinical combination of traditional Chinese medicine.

MXF；Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus；Normal mice model infected with influenza virus；Influenza virus H1N1；MXF

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2072-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.002

2015-06-03）

国家科技重大专项（2014ZX09509001-001）；国家自然科学基金项目（81273626）；山东省中医药科技发展计划（2013-026）

（电子邮箱：yy7204@163.com）