光动力疗法对表达人乳头瘤病毒16 E7蛋白的HaCaT细胞株增殖和凋亡的影响

缪飞 王秀丽 吕婷 石磊 张玲琳 王宏伟

光动力疗法对表达人乳头瘤病毒16 E7蛋白的HaCaT细胞株增殖和凋亡的影响

缪飞 王秀丽 吕婷 石磊 张玲琳 王宏伟

目的 探讨氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对表达人乳头瘤病毒16 E7蛋白的HaCaT细胞株（简称HaCaT/HPV16 E7）增殖和凋亡的影响。方法 HaCaT/HPV16 E7细胞株分为4组，即空白组、单纯光敏剂组、单纯照射组（12 J/cm2）、不同光剂量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT组，细胞与氨基酮戊酸（ALA）共孵育5 h，采用波长630 nm、功率30 mW/cm2红光照射，CCK8法检测细胞24 h后存活率，流式细胞仪检测细胞3 h的凋亡率，显微镜观察细胞形态。结果 空白组、单纯光敏剂组、单纯照射组（12 J/cm2）、不同光剂量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT照射细胞24 h，细胞生长存活率分别为99.15%±0.64%、98.13%±0.83%、96.85%±1.37%、68.98%± 1.03%、46.03%±2.96%、23.57%±3.83%，后3组ALA-PDT组与其他3组比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）。随着光剂量升高，细胞凋亡逐渐增加，细胞形态发生明显改变，细胞皱缩。结论 ALA光动力抑制HPV感染细胞增殖并促进细胞发生凋亡，在一定光剂量范围内，呈剂量依赖性。

氨基酮戊酸；光化学疗法；细胞增殖；细胞凋亡；α乳头状瘤病毒属；人乳头瘤病毒16 E7蛋白

氨基酮戊酸光动力疗法（aminolaevulinic acidphotodynamic therapy，ALA-PDT）已成功治疗尖锐湿疣和宫颈高危人乳头瘤病毒（HPV）感染，并显示出其特有的优越性［1-2］。但其破坏HPV感染细胞的机制及细胞内作用的靶点尚未完全阐明。由于HPV种属的特异性，目前尚缺乏HPV动物模型，体外亦无法培养。因此，有关HPV的研究就聚焦在HPV某一基因转染到HaCaT细胞中［3-4］。我们前期已建立表达人乳头瘤病毒16 E7蛋白的HaCaT细胞株（简称HaCaT/HPV16 E7）［5］，本实验以HaCaT/HPV16 E7细胞株作为HPV感染细胞的模型，在细胞学水平分析ALA-PDT对HPV感染细胞增殖和凋亡的影响。

材料和方法

一、材料与仪器

HaCaT/HPV16 E7细胞株均为本院中心实验室保存。DMEM培养基、geneticin®（G418，美国Gibco公司），CCK8试剂盒、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（美国Invitrogen公司），ALA粉剂（上海复旦张江生物医药股份有限公司）。LED实验光源由荷兰Philips公司为本实验特别搭建，波长630 nm，辐射计测得实际输出功率为30 mW/cm2；荧光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）；流式细胞仪（型号FACSAria，美国BD公司）由上海复旦大学公共卫生临床中心实验室提供。

二、实验方法

1.细胞培养：HaCaT/HPV16 E7细胞置于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 μg/ml）、G418（终浓度为0.5 g/L）的DMEM培养基中培养。HaCaT/HPV16 E7细胞生长至90%融合时，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化培养细胞，制备单一细胞悬液，采用计数板计数法，以5×103个细胞/孔接种于96孔板中，每孔体积200 μl，设3个复孔。

2.分组处理：上述培养好的HaCaT/HPV16 E7细胞分为4组，即空白组、单纯光敏剂组、单纯照射组（12 J/cm2）、不同光剂量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT组。①空白组：细胞未做任何处理；②单纯光敏剂组：细胞培养24 h后，吸除原培养基，加入终浓度为1 mmol/L ALA的培养基后，用锡纸包裹96孔板继续培养；③单纯照射组：细胞照射前吸出培养液，用PBS液冲洗2遍；96孔板用自制遮光罩保护，在未接种细胞的孔内加入微孔过滤后的墨汁以避免光衍射；揭开需要光处理的细胞孔，用30 mW/cm2功率密度的630 nm LED红光照射，照射距离为1 cm，照射剂量12 J/cm2；④ALA-PDT组：细胞培养24 h后，吸除原培养基，加入终浓度为1 mmol/L ALA的培养基后，用锡纸包裹96孔板；避光培养5 h后，吸出培养液，用PBS液冲洗2遍；其他处理及照射方法同单纯照射组；经预实验并参考相关文献［6］，设定照射能量分别为4、8、12 J/cm2。照射完毕后处理同单纯照射组。

3.CCK8法检测细胞增殖：上述细胞处理24 h后加入10 μl CCK8溶液，培养2 h后终止，用酶联免疫检测仪于波长450 nm处测定吸光度（A值）。细胞存活率（%）=（处理组A值/对照组A值）× 100%。

4.流式细胞仪检测细胞凋亡：采用Annexin V＋碘化丙锭（PI）双染色法，收集上述处理3 h后的细胞约5万～10万个，加入195 μl结合缓冲液重悬，离心，弃上清液，加入5 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min，再次离心弃上清液，加入190 μl结合缓冲液重悬细胞，加入10 μl PI染色液，混匀，冰浴避光放置5 min，随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。流式细胞仪检测FITC时使用FL-4通道，用远红外通道检测PI荧光。早期凋亡细胞为Annexin V（＋）/PI（-），Annexin V-FITC和PI双阳性的为晚期凋亡细胞或死亡细胞，Annexin V-FITC（-）和PI（＋）为死亡细胞［7-8］。用CellQuest软件分析。实验重复3次。

5.观察细胞密度与细胞形态：ALA-PDT处理细胞后3 h，立即在共聚焦显微镜下观察各组细胞一般形态学变化。ALA-PDT处理细胞后24 h，倒置相差显微镜观察细胞生长密度。

三、统计学处理

结果

一、细胞增殖情况

空白组、单纯光敏剂组、单纯照射组（12 J/cm2）、不同光剂量（4、8、12 J/cm2）ALA-PDT组处理24 h后，细胞生长存活率分别为 99.15%±0.64%、98.13%±0.83%、96.85%±1.37%、68.98%±1.03%、46.03%±2.96%、23.57%±3.83%。单因素方差分析显示，6组间差异有统计学意义（F=942.667，P＜0.001）。4、8、12 J/cm2ALT-PDT组分别与空白组、单纯光敏剂组、单纯照射组比较，ALT-PDT 3组的细胞存活率均明显降低（均P＜0.001），且随着ALA-PDT组照光剂量的增加，细胞存活率降低（单因素方差分析，均P＜0.001）。此外，空白组、单纯光敏剂组、单纯照射组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

二、细胞凋亡情况

流式细胞仪检测ALA-PDT处理HaCaT/HPV16 E7细胞3 h后的细胞凋亡及死亡百分比，结果显示，单纯ALA处理后，23.90%±1.85%的HaCaT/ HPV16 E7细胞死亡。随着照射剂量（4、8、12 J/cm2）的增加，细胞凋亡和死亡的比例明显增加（分别为36.77%±2.66%、86.13%±5.37%、86.87%±3.20%），4、8、12 J/cm2ALT-PDT组分别与单纯光敏剂组相比，细胞死亡比例均明显增高（P值分别 ＜0.01，＜0.001、＜0.001）；见图1。此外，单纯光敏剂组和单纯照射组（22.9%±2.46%）分别与空白对照组（20.8%±1.19%）比较，细胞凋亡和死亡差异无统计学意义（均P＞0.05）。

图1 流式细胞仪检测不同照光剂量（4、8、12 J/cm2）光动力对HaCaT/HPV16 E7细胞照射后3 h凋亡和死亡情况 随着照光剂量的增加，HaCaT/HPV16 E7细胞凋亡和死亡的比例明显增加

三、倒置相差显微镜检测结果

成熟的HaCaT/HPV16 E7细胞株贴壁良好，细胞饱满，胞质丰富、均匀。随着光动力剂量增加细胞生长密度逐渐降低，细胞出现空泡样改变，结构模糊（图2）。

图2 倒置相差显微镜下观察0、4、8、12 J/cm2光动力处理HaCaT/HPV16 E7细胞株24 h后细胞生长密度（×100） 随着光动力剂量增加，细胞生长密度逐渐降低，细胞出现空泡样改变，结构模糊

四、聚焦显微镜检测结果

随着光动力能量的增高，HaCaT/HPV16 E7细胞形态发生明显改变，细胞皱缩，间隙增大，脱落细胞也逐渐增多（图3）。

讨论

近年来，ALA-PDT治疗寻常疣、跖疣、尖锐湿疣等HPV相关疾病，疗效好、复发率低，受到临床医生的青睐［7］。本研究结合前期实验结果及文献报道［8-9］，选用1 mmol/L的ALA浓度，孵育时间5 h。

磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，为吞噬细胞提供可识别的信号［10］。Annexin V是一种相对分子质量为35 000～36 000的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对于凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜使细胞核红染。因此，Annexin V进行荧光素标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针与PI匹配使用，就可以把凋亡早晚期的细胞以及死亡细胞区分开来。我们采用Annexin V/PI双染法，通过流式细胞仪检测不同剂量（0、4、8、12 J/cm2）ALA-PDT后3 h HaCaT/HPV16 E7细胞凋亡及死亡的比例，结果显示，随着光剂量的增加，细胞的凋亡和死亡明显增加，呈一定的剂量依赖性。

本研究显示，随着光动力剂量的增加，HaCaT/ HPV16 E7细胞的增殖受到明显抑制，亦呈剂量依赖性。在显微镜下，随着PDT能量的增加，细胞密度逐渐降低，胞质内颗粒逐渐增多，颜色加深，细胞间隙增大，细胞出现空泡变性，细胞形态皱缩。研究结果提示，ALA-PDT可通过抑制HPV感染细胞增殖促进其凋亡，其具体凋亡途径尚待进一步研究。

［1］Wang HW,Zhang LL,Miao F,et al.Treatment of HPV infectionassociated cervical condylomata acuminata with 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy［J］.Photochem Photobiol, 2012,88（3）:565-569.

［2］Kostovic K,Pastar Z,Ceovic R,et al.Photodynamic therapy in dermatology:currenttreatmentsand implications［J］.Coll Antropol,2012,36（4）:1477-1481.

［3］Kabsch K,Alonso A.The human papillomavirus type 16 E5 protein impairs TRAIL-and FasL-mediated apoptosis in HaCaT cells by different mechanisms［J］.J Virol,2002,76（23）:12162-12172.

［4］Severino A,Abbruzzese C,Manente L,et al.Human papillomavirus-16 E7 interacts with Siva-1 and modulates apoptosis in HaCaT human immortalized keratinocytes［J］.J Cell Physiol,2007,212（1）:118-125.

［5］缪飞,王秀丽,王宏伟,等.稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（5）:310-313.

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［7］Darlenski R,Fluhr JW.Photodynamic therapy in dermatology:past, present,and future［J］.J Biomed Opt,2013,18（6）:061208.

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Effects of photodynamic therapy on the proliferation and apoptosis of human papillomavirus type 16 E7 proteinexpressing HaCaT cells

Miao Fei*,Wang Xiuli,Lyu Ting,Shi Lei,Zhang Linglin,Wang Hongwei.*Huadong Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200040,China
Corresponding author:Wang Hongwei,Email:hongweiwang2005@aliyun.com

ObjectiveTo explore the effects of aminolevulinic acid-based photodynamic therapy（ALA-PDT）on the proliferation and apoptosis of HaCaT cells stably expressing human papillomavirus type 16 E7 protein（HaCaT/ HPVl6 E7 cells）.MethodsCultured HaCaT/HPV16 E7 cells were divided into several groups:blank control group receiving no treatment,ALA group treated with ALA alone,irradiation group irradiated with 630-nm red laser（30 mW/cm2, 12 J/cm2）,ALA-PDT groups pretreated with ALA for 5 hours followed by 630-nm red laser radiation at 4,8,12 J/cm2respectively.CCK8 assay was performed to determine the survival rate of cells at 24 hours after PDT,and flow cytometry and confocal microscopy were conducted to detect cell apoptosis and observe cell morphology respectively at 3 hours.ResultsAt 24 hours,the survival rate of cells was 68.98%±1.03%,46.03%±2.96%and 23.57%±3.83%in the 4-, 8-and 12-J/cm2ALA-PDT groups respectively,significantly lower than that in the blank control group,ALA group and irradiation group（99.15%±0.64%,98.13% ±0.83%and 96.85%±1.37%respectively,allP＜0.05）.With the increase in radiation dose,cell apoptosis was accelerated with obvious morphological changes and shrinkage of cells in the ALA-PDT groups.ConclusionALA-PDT can inhibit the proliferation,and promote the apoptosis of HPV-infected HaCaT cells in a dose-dependent manner within a certain range of radiation dose.

Aminolevulinic acid;Photochemotherapy;Cell proliferation;Apoptosis;Alphapapillomavirus; HPV16 E7

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.005

国家自然科学基金（30972665）；上海市自然科学基金（08ZR1417400）；上海市卫生系统先进适宜技术推广项目（2013SY007）；上海市卫生局科研课题计划（20124034）；上海市级医院临床科研资源共享平台项目（SHDC12007703）

200040上海，复旦大学附属华东医院（缪飞、吕婷、王宏伟）；上海市皮肤病医院（王秀丽、石磊、张玲琳）

王宏伟，Email：hongweiwang2005@aliyun.com

2015-01-06）

（本文编辑：周良佳 颜艳）